Пространственный и временный контроль Мурин Меланомы Инициация от мутантных меланоцитов стволовых клеток
Summary
Следующая процедура описывает метод пространственного и временного контроля меланоцитарной опухоли инициации в куринной дорсальной кожи, используя генетически инженерии мыши модели. Этот протокол описывает макроскопические, а также микроскопические кожной меланомы инициации.
Abstract
Кожная меланома хорошо известна как самый агрессивный рак кожи. Хотя факторы риска и основные генетические изменения продолжают фиксироваться с увеличением глубины, частота заболеваемости кожной меланомой в последние десятилетия быстро и непрерывно растет. Для того, чтобы найти эффективные профилактические методы, важно понимать ранние шаги начала меланомы в коже. Предыдущие данные показали, что фолликулярные меланоциты стволовых клеток (MCSCs) в тканях кожи взрослой кожи может выступать в качестве клеток меланомы происхождения при выражении онкогенных мутаций и генетических изменений. Tumorigenesis возникает от меланомы подверженных MCSCs может быть вызвано при переходе MCSCs от покоя к активному состоянию. Этот переход в меланомы подверженных MCSCs может быть повышена путем модуляции либо волосяного фолликула стволовых клеток состояние или через внутренние экологические факторы, такие как ультрафиолет-B (УФ-B). Эти факторы могут быть искусственно манипулировать в лаборатории путем химического депиляции, которая вызывает переход стволовых клеток волосяного фолликула и MCSCs от тихого к активному состоянию, и УФ-B воздействия с помощью скамейки света. Эти методы обеспечивают успешный пространственный и временный контроль кожной меланомы инициации в куринной донской кожи. Таким образом, эти системы in vivo будут полезны для определения ранних этапов начала кожной меланомы и могут быть использованы для тестирования потенциальных методов профилактики опухоли.
Introduction
Меланома, злокачественная форма меланоцитических опухолей, является наиболее агрессивным раком в коже с кожной меланомой, ответственной за большинство случаев смерти от рака кожи1. В Соединенных Штатах, меланома обычно диагностируется; по прогнозам, это будет 5-й до 6-й наиболее распространенный тип рака среди предполагаемых новых случаев рака в 2018году 2. Кроме того, в то время как общие заболеваемости раком показали тенденцию постепенного сокращения в последние десятилетия, кожные показатели заболеваемости меланомой в течение последних нескольких десятилетий демонстрируют непрерывное и быстрое увеличение обоих полов2.
Для более эффективной борьбы с кожной меланомой важно четко понимать ранние события развития меланомы из их клеток происхождения, чтобы лучше определить клинически эффективные профилактические методы. В настоящее время известно, что взрослые стволовые клетки могут значительно способствовать образованию опухоли, как клеточного происхождения рака во многих различных типах органов, включая ткани кожи3,4,5. Аналогичным образом, взрослые стволовые клетки меланоцитов (MCSCs) в куринской нижней кожи может работать как клетки меланомы происхождения при аномальной активации Рас / Раф и Акт пути6. Тем не менее, эти онкогенные мутации сами по себе не в состоянии эффективно вызвать образование опухоли от тихих MCSCs. Меланоцитические опухоли в конечном итоге развиваться, когда MCSCs становятся активными во время естественного цикла волос. Однако, в этом протоколе, мы опишите методы искусственного индуцирования клеточной активации подверженных опухоли MCSCs, тем самым облегчая точный контроль меланомы инициации6,7.
С помощью методов, описанных здесь, пространственный и временный контроль кожной меланомы инициации от опухолевых MCSCs, выражающих онкогенные BrafV600E вместе с потерей экспрессии Pten может быть успешно выполнена, как мы ранее сообщалио 6. Этот метод включает в себя предыдущие выводы, которые демонстрируют активации волосяного фолликула через депиляцию, а также как воздействие кожи мурина на УФ-В может способствовать активации MCSCs резидентов волосяного фолликула и транслокации этой клеточной субпопуляции до межфолликулярной эпидермис6,8,9,10. Эти системы in vivo могут предоставить ценную информацию о том, как физиологические и экологические изменения могут изменить клеточный статус меланомы подверженных MCSCs, которые, в свою очередь, может вызвать значительное начало меланомы в коже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hallmark генетические изменения часто встречаются в кожной меланомы опухолей были хорошо описаны13. Наиболее доминирующей мутацией драйвера является BrafV600E, а генетически модифицированная модель мыши для Braf V600E-опосредованноемеланома была создана группо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Управлением помощника министра обороны по вопросам здравоохранения, в рамках программы исследования рака Peer Reviewed в рамках премии W81XWH-16-1-0272. Мнения, толкования, выводы и рекомендации являются мнениями авторов и не обязательно одобрены министерством обороны. Эта работа была также поддержана семенной грант от Корнельской программы стволовых клеток для A.C. White. H. Moon был поддержан Корнельским центром позвоночной геномики Стипендиат программы.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Referências
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C. Tracing the cellular origin of cancer. Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M. SnapShot: melanoma. Cancer Cell. 23 (5), (2013).
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
