שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט
Summary
הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.
Abstract
מלנומה עורית ידועה כסרטן העור האגרסיבי ביותר. למרות גורמי הסיכון ושינויים גנטיים העיקריים להמשיך להיות מתועד עם עומק הגוברת, שיעור השכיחות של מלנומה עורית הראה עלייה מהירה ורציפה במהלך העשורים האחרונים. כדי למצוא שיטות מניעה יעיל, חשוב להבין את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה בעור. הנתונים הקודמים הוכיחו כי בתאי גזע מלנוציט הזקיקים (MCSCs) ברקמות העור המבוגר יכול לשמש כתאי מלנומה של המקור בעת המבטא מוטציות אונגניים ושינויים גנטיים. Tuמוריגנזה הנובעים MCSCs נוטה מלנומה יכול להיגרם כאשר MCSCs מעבר מן השקט למצב פעיל. מעבר זה מלנומה נוטה MCSCs ניתן לקדם על ידי אפנון של או שיער זקיק תאי גזע המדינה פעילות או באמצעות גורמים סביבתיים חיצוניים כגון אולטרה סגול-B (UV-B). גורמים אלה יכולים להיות מניפולציות באופן מלאכותי במעבדה על ידי depilation כימיים, מה שגורם מעבר של תאי גזע שיער זקיק ו מן השקט למצב פעיל, ועל ידי חשיפה UV-B באמצעות אור שספסל העליון. שיטות אלה מספקות שליטה מרחבית מוצלחת והטמפורלית של חניכה מלנומה עורית בעור מוריין. לכן, אלה במערכות מודל vivo יהיה בעל ערך להגדיר את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה עורית יכול לשמש כדי לבדוק שיטות פוטנציאליות למניעת גידול.
Introduction
מלנומה, הצורה המממנת של גידולים מלנולוציפטיים, הוא הסרטן האגרסיבי ביותר בעור עם מלנומה עורית אחראי על רוב מקרי המוות של סרטן העור1. בארצות הברית, מלנומה מאובחנת בדרך כלל; הוא הוקרן להיות 5 עד 6th הסרטן הנפוץ ביותר בקרב המקרים המשוער סרטן חדש ב 20182. יתר על כן, בעוד מקרי סרטן הכולל הראו את המגמה של צמצום הדרגתי בעשורים האחרונים, מלנומה עורית שיעור שיעור במהלך העשורים האחרונים להפגין עלייה רציפה ומהירה בשני המינים2.
כדי להילחם מלנומה עורית ביעילות רבה יותר, חשוב להבין בבירור את האירועים המוקדמים של פיתוח מלנומה מתאי המוצא שלהם לזהות טוב יותר קלינית שיטות מניעה יעיל. ידוע כיום כי בתאי גזע בוגרים יכולים לתרום באופן משמעותי להיווצרות הגידול כמקורות הסלולר של סרטן בסוגים רבים ושונים של איברים כולל רקמות העור3,4,5. באופן דומה, מבוגרים תאי גזע מלנוציט (MCSCs) בעור המורין הישן יכול לעבוד כתאי מלנומה של המקור על הפעלה חריגה של Ras/חיל הארץ ו akt מסלולים6. עם זאת, אלה מוטציות אונגניים לבד אינם מסוגלים ביעילות לגרום להיווצרות הגידול מן השקט MCSCs. גידולים מלנולוציפטיים בסופו של דבר להתפתח כאשר MCSCs להיות פעיל במהלך רכיבה על שיער טבעי. עם זאת, בפרוטוקול זה, נתאר שיטות כדי לגרום באופן מלאכותי הפעלה תאית של MCSCs מועדת הגידול, ובכך להקל על שליטה מדויקת של חניכה מלנומה6,7.
באמצעות השיטות המתוארות כאן, שליטה מרחבית וטמפורלית של חניכה מלנומה עורית מפני גידול MCSCs ביטוי אונגניים BrafV600E יחד עם אובדן של ביטוי pten ניתן לבצע בהצלחה, כמו שאנחנו דיווחו בעבר על6. שיטה זו משלבת ממצאים קודמים כי הפגנת שיער זקיק גזע הפעלה של תא דרך הסרת שיער כמו גם איך חשיפה של העור murine ל-UV-B יכול להקל על ההפעלה של MCSCs תושב זקיק השיער וטרנסלוקציה של הסלולר הזה אוכלוסיית המשנה לאפידרמיס הפוליקולרית6,8,9,10. אלה במערכות מודל vivo יכול לספק מידע חשוב לגבי איך שינויים פיסיולוגיים וסביבתיים יכולים לשנות את הסטטוס התאי של מלנומה נוטה MCSCs, אשר בתורו יכול לגרום לחניכה משמעותית של מלנומה בעור.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההיכר שינויים גנטיים לעתים קרובות למצוא גידולים מלנומה עורית כבר תיאר היטב13. המוטציה הדומיננטית ביותר הנהג הוא BrafV600E, ומודל מהונדסים גנטית העכבר עבור brafV600E-תיווך מלנומה נוצר על ידי קבוצת Bosenberg14 והופקד במעבדה ג’קסון. באמצעות מודל זה של העכבר, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי Office של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות, באמצעות התוכנית לחקר הסרטן שנסקרו עמית תחת הפרס W81XWH-16-1-0272. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחברים ואינן בהכרח מיוחסות על-ידי משרד ההגנה. עבודה זו הייתה נתמכת גם על ידי מענק זרע מהתוכנית הגזע קורנל לייט. H. Moon נתמך על ידי מרכז קורנל על תוכנית המלומדים בעלי חוליות גנומיקה.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Referências
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C. Tracing the cellular origin of cancer. Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M. SnapShot: melanoma. Cancer Cell. 23 (5), (2013).
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
