Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes
Summary
O procedimento a seguir descreve um método para o controle espacial e temporal da iniciação do tumor melanocítico na pele dorsal murina, utilizando um modelo de camundongo geneticamente projetado. Este protocolo descreve macroscópica assim como a iniciação Cutaneous microscópica da melanoma.
Abstract
O melanoma cutâneo é bem conhecido como o câncer de pele mais agressivo. Embora os factores de risco e as alterações genéticas principais continuem a ser documentados com profundidade crescente, a taxa de incidência do melanoma Cutaneous mostrou um aumento rápido e contínuo durante décadas recentes. A fim encontrar métodos preventivos eficazes, é importante compreender as etapas adiantadas da iniciação da melanoma na pele. Os dados precedentes demonstraram que as pilhas de haste foliculares do melanócito (mcscs) nos tecidos adultos da pele podem actuar como pilhas da melanoma da origem ao expressar mutações oncogênico e alterações genéticas. O tumorigenesis que levanta-se de MCSCs melanoma-prone pode ser induzido quando MCSCs transição de um quiescente ao estado ativo. Essa transição em MCSCs propenso a melanoma pode ser promovida pela modulação do estado de atividade das células-tronco do folículo piloso ou por meio de fatores ambientais extríncicos, como ultravioleta-B (UV-B). Estes fatores podem ser manipulados artificialmente no laboratório pela depilação química, que causa a transição de pilhas de haste do folículo de cabelo e de mcscs de um quiescente ao estado ativo, e pela exposição de UV-B usando uma luz do de bancada. Estes métodos fornecem o controle espacial e temporal bem sucedido da iniciação Cutaneous da melanoma na pele dorsal murino. Conseqüentemente, estes sistemas in vivo do modelo serão valiosos para definir as etapas adiantadas da iniciação cutaneous do melanoma e poderiam ser usados para testar métodos potenciais para a prevenção do tumor.
Introduction
O melanoma, a forma maligna dos tumores melanocíticos, é o câncer mais agressivo na pele com melanoma cutâneo responsável pela maioria das mortes por câncer de pele1. Nos Estados Unidos, o melanoma é comumente diagnosticado; prevê-se que seja o 5º a 6º tipo de cancro mais comum entre os novos casos de cancro estimados em 20182. Além disso, embora as incidências globais de câncer tenham demonstrado a tendência de redução gradual nas últimas décadas, as taxas de incidência de melanoma cutâneo nas últimas décadas demonstram um aumento contínuo e rápido em ambos os sexos2.
Para combater o melanoma cutâneo de forma mais eficiente, é importante entender claramente os primeiros acontecimentos do desenvolvimento de melanoma de suas células de origem para melhor identificar métodos preventivos clinicamente efetivos. É sabido agora que as pilhas de haste adultas podem significativamente contribuir à formação do tumor como as origens celulares dos cancros em muitos tipos diferentes de órgãos que incluem os tecidos da pele3,4,5. Similarmente, as pilhas de haste adultas do melanócito (mcscs) na pele dorsal murino podem trabalhar como pilhas da melanoma da origem em cima da ativação aberrante das vias Ras/Raf e de Akt 6. Entretanto, estas mutações oncogênico sozinho não são capazes de induzir eficientemente a formação do tumor dos mcscs quiescentes. os tumores melanocíticos eventualmente desenvolvem-se quando mcscs se torna ativo durante a ciclagem natural do cabelo. No entanto, neste protocolo, descreveremos métodos para induzir artificialmente a ativação celular de mcscs propenso a tumores, facilitando assim o controle preciso do início do melanoma6,7.
Através dos métodos descritos aqui, o controle espacial e temporal da iniciação cutânea do melanoma de mcscs tumor-propenso expressando BRAFV600E oncogênico junto com a perda de expressão de PTEN pode com sucesso ser executado, porque nós relataram anteriormente6. Este método incorpora os resultados precedentes que demonstram a ativação da pilha de haste do folículo de cabelo com a depilação assim como como a exposição da pele murino a UV-B pode facilitar a ativação do residente de mcscs ao folículo de cabelo e ao translocação deste celular subpopulação à epiderme interfolicular6,8,9,10. Estes sistemas in vivo do modelo podem fornecer a informação valiosa a respeito de como as mudanças fisiológicas e ambientais podem alterar o status celular de MCSCs melanoma-prone, que por sua vez podem induzir a iniciação significativa do melanoma na pele.
Protocol
Representative Results
Discussion
As alterações genéticas do Hallmark freqüentemente encontradas em tumores Cutaneous da melanoma foram descritas bem13. A mutação de condutor mais dominante é o BRAFV600E, e um modelo de rato geneticamente concebido para o melanoma mediado por BRAFV600Efoi gerado pelo grupo Bosenberg14 e depositado no laboratório Jackson. Usando este modelo do rato, nosso estudo recente demonstrou a exigência da ativação celular de MCSCs tum…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo gabinete do secretário adjunto de defesa para os assuntos da saúde, através do programa de pesquisa de câncer de peer revisado o prêmio W81XWH-16-1-0272. As opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as dos autores e não são necessariamente endossadas pelo departamento de defesa. Este trabalho também foi apoiado por uma concessão de sementes do programa de células-tronco de Cornell para A.C. White. H. Moon foi apoiado pelo Cornell Center for vertebrate Genomics Scholar Program.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Referências
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