Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes
Summary
El siguiente procedimiento describe un método para el control espacial y temporal del inicio del tumor melanocítico en la piel dorsal murina, utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente. Este protocolo describe el inicio de melanoma cutáneo macroscópico y microscópico.
Abstract
El melanoma cutáneo es bien conocido como el cáncer de piel más agresivo. Aunque los factores de riesgo y las principales alteraciones genéticas continúan documentándose con una profundidad cada vez mayor, la tasa de incidencia del melanoma cutáneo ha mostrado un aumento rápido y continuo durante las últimas décadas. Con el fin de encontrar métodos preventivos efectivos, es importante entender los primeros pasos de iniciación del melanoma en la piel. Los datos anteriores han demostrado que las células madre foliculares de melanocito (MCSC) en los tejidos de la piel adulta pueden actuar como células del melanoma de origen al expresar mutaciones oncogénicas y alteraciones genéticas. La tumorigénesis derivada de los MCSC propensos al melanoma puede inducirse cuando la MCSCs se transición de un estado inactivo al activo. Esta transición en MCSCs propenso al melanoma puede ser promovida por la modulación del estado de actividad de las células madre del folículo piloso o a través de factores ambientales extrínsecos como el ultravioleta-B (UV-B). Estos factores pueden ser manipulados artificialmente en el laboratorio por depilación química, lo que provoca la transición de las células madre del folículo piloso y MCSC de un estado inactivo a activo, y por la exposición UV-B usando una luz de sobremesa. Estos métodos proporcionan un control espacial y temporal exitoso del inicio del melanoma cutáneo en la piel dorsal murina. Por lo tanto, estos sistemas modelo in vivo serán valiosos para definir los primeros pasos del inicio del melanoma cutáneo y podrían utilizarse para probar métodos potenciales para la prevención de tumores.
Introduction
El melanoma, la forma maligna de los tumores melanocíticos, es el cáncer más agresivo en la piel con melanoma cutáneo responsable de la mayoría de las muertes por cáncer de piel1. En los Estados Unidos, el melanoma es comúnmente diagnosticado; se proyecta que es el tipo de cáncer más común de 5 a 6 entre los nuevos casos de cáncer estimados en 20182. Además, si bien las incidencias generales del cáncer han mostrado la tendencia de reducción gradual en las últimas décadas, las tasas de incidencia de melanoma cutáneo durante las últimas décadas demuestran un aumento continuo y rápido en ambos sexos2.
Para combatir el melanoma cutáneo de manera más eficiente, es importante comprender claramente los primeros acontecimientos del desarrollo del melanoma desde sus células de origen para identificar mejor los métodos preventivos clínicamente efectivos. Ahora se sabe que las células madre adultas pueden contribuir significativamente a la formación de tumores como los orígenes celulares de los cánceres en muchos tipos diferentes de órganos, incluyendo los tejidos de la piel3,4,5. Del mismo modo, las células madre adultas de melanocito (MCSC) en la piel dorsal murina pueden funcionar como células del melanoma de origen tras la activación aberrante de la Ras/Raf y las vías de Akt 6. Sin embargo, estas mutaciones oncogénicas por sí solas no son capaces de inducir eficientemente la formación de tumores de los MCSC en reposo. los tumor melanocíticos eventualmente se desarrollan cuando los MCSC se vuelven activos durante el ciclo natural del cabello. Sin embargo, en este protocolo, describiremos métodos para inducir artificialmente la activación celular de los mcscs propensos a tumores, facilitando así el control preciso de la iniciación del melanoma6,7.
A través de los métodos descritos aquí, el control espacial y temporal del inicio del melanoma cutáneo de MCSCs propensos a tumores que expresan BRAF oncogénicoV600E junto con la pérdida de la expresión PTEN se puede realizar con éxito, ya que han reportado previamente6. Este método incorpora hallazgos previos que demuestran la activación de las células del folículo piloso a través de la depilación, así como la exposición de la piel murina a UV-B puede facilitar la activación de los residentes de MCSCs en el folículo piloso y la translocación de este celular subpoblación a la epidermis interfolicular6,8,9,10. Estos sistemas modelo in vivo pueden proporcionar información valiosa sobre cómo los cambios fisiológicos y ambientales pueden alterar el estado celular de los MCSC propensos al melanoma, que a su vez pueden inducir un inicio significativo del melanoma en la piel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las alteraciones genéticas distintivas que se encuentran frecuentemente en tumores de melanoma cutáneo han sido bien descritas13. La mutación del conductor más dominante es BRAFV600E, y un modelo de ratón genéticamente diseñado para el melanoma de BRAFV600Emediado fue generado por el grupo Bosenberg14 y depositado en el laboratorio Jackson. Con este modelo de ratón, nuestro estudio reciente demostró el requisito de la activac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la oficina del Subsecretario de defensa para asuntos de salud, a través del programa de investigación de cáncer de Peer revisado bajo el premio W81XWH-16-1-0272. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de defensa. Este trabajo también fue apoyado por una subvención de semillas del programa de células madre de Cornell a A.C. White. H. Moon fue apoyada por el Cornell Center para el programa académico de genómica de vertebrados.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Referências
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