Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag
Summary
De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.
Abstract
De in vitro invasie test gebruikt een eiwitrijke matrix in een Boyden kamer om het vermogen van gekweekte cellen te meten door de matrix en een poreus membraan te passeren in een proces dat analoog is aan de initiële stappen van kankercellen metastasen. De geteste cellen kunnen worden gewijzigd voor de genexpressie of worden behandeld met remmers om te testen op veranderingen in het invasie potentieel. Dit experiment test het agressieve fenotype van de muizen-borstkanker tumorcellen te ontdekken en karakteriseren de potentiële oncogenen die celinvasie bevorderen. Deze techniek kan echter veelzijdig zijn en aan veel verschillende toepassingen worden aangepast. Het experiment zelf kan worden gedaan in een dag en de resultaten worden verworven door lichte microscopie in minder dan een dag. De resultaten omvatten tellingen van het aantal binnenvallende cellen voor vergelijking en analyse. De in vitro invasie test is een snelle, goedkope en duidelijke methode voor het bepalen van het Celgedrag in een cultuur die kan worden gebruikt als een initiële beoordeling voordat er meer bij vivo-testen wordt betrokken.
Introduction
De in vitro invasie test kan een nuttig hulpmiddel zijn bij het meten van het vermogen van een cel om te migreren via een eiwit gecoat membraan, analoog aan de eerste stappen in metastasen. Een belangrijk kenmerk van kwaadaardige kankercellen is hun vermogen om te migreren door en binnendringen in de buurt weefsels. Kanker die zich heeft verspreid of metastaseert, brengt meer behandelings uitdagingen met zich mee en heeft een lager percentage langdurig overleven, terwijl gelokaliseerde tumoren gemakkelijker te behandelen zijn en hogere percentages van overleving op lange termijn hebben. Om metastaseren, kankercellen moeten verlaten van de primaire tumor en migreren naar de bloedsomloop of lymfestelsel, een proces dat het passeren van de extracellulaire matrix en kelder membraan1vereist. In het proces genaamd de epitheliale mesenchymale transitie (EMT), moeten de tumorcellen celcelcontacten breken, directioneel migreren en nabijgelegen bloed of lymfevaten binnendringen. De eerste stappen van deze metastasen Cascade zijn van groot belang, omdat deze stappen zijn wat kan kanker Deadlier maken. De genetische en epigenetische factoren die betrokken zijn bij de eerste stappen van metastase zijn de focus van een grote hoeveelheid onderzoek, maar nauwkeurige en betrouwbare experimentele instrumenten zijn nodig om deze vroege stappen zowel in vivo als in vitro te testen.
Hulpmiddelen voor het meten van veranderingen in Celmigratie zoals wondgenezing (scratch) of groei in 3D-omgevingen zoals zachte agar-assays kunnen gedeeltelijk de behoefte aan experimentele methoden voor het meten van vroege stappen van metastasen aanpakken, maar een test om de invasie te meten is meer uitdagend omdat het proces in het lichaam in een complexe tumor micro-omgeving optreedt. Met het oog op de screening van geneesmiddelen of genveranderingen om belangrijke factoren in de invasie en metastase te bepalen, een systeem dat in vitro met gekweekte cellen kan worden gebruikt en de uitdagingen waarmee gemetastaseerde cellen worden geconfronteerd na te bootsen, is de invasie test2, 3. Borstkanker is de meest gediagnosticeerde vorm van kanker bij vrouwen en de tweede belangrijkste oorzaak van de kanker sterfte bij vrouwen, dus het begrijpen van de genen die verantwoordelijk zijn voor de invasie van borstkanker cellen en metastase is van cruciaal belang voor de volksgezondheid. Bovendien zijn muis cellen een handig modelsysteem voor het bestuderen van borstkanker en de progressie ervan.
De in vitro invasie test is gebaseerd op de vergadering van de Boyden Chamber, waar twee kamers van groeimedia worden gescheiden door een poreus membraan3. Om na te bootsen van de tumor micro omgeving, een eiwitrijke gel is ook opgenomen om cellen in één kamer van een chemoaantretant in de andere scheiden en fungeren als een kelder membraan barrière. Om te migreren naar de chemoaantretant, moeten cellen eerst door de eiwitrijke barrière passeren en vervolgens door het poreuze membraan passeren-een proces dat analoog is aan hoe gemetastaseerde cellen migreren via stroma. De proteïnerijke gel kan worden aangepast op basis van de behoeften van het experiment, maar bestaat meestal uit collageen, of kelder membraan extract (bijv. Matrigel)4. Het is een complex mengsel van eiwitten, proteoglycanen en groeifactoren, maar meestal bestaat uit lamininen en collageen IV 4,5. Cellen moeten dan een poreus membraan passeren dat typisch is gemaakt van polycarbonaat, polyester of polytetrafluorethyleen (PTFE). Membranen kunnen commercieel worden gekocht met of zonder een proteïne-gel (meestal collagens), of de gel kan afzonderlijk worden aangeschaft en toegevoegd. De poriegrootte kan worden aangepast op basis van de celgrootte. Hoewel porie maten verkrijgbaar zijn van 0,4-8,0 μm, zijn alleen poriën van 3,0-8,0 μm groot genoeg voor Celmigratie. De invasie test is gebruikt om de effectiviteit te bepalen van remmers op het vermogen van cellen om te migreren en binnen te vallen. Terwijl de exacte tumor micro omgeving ontbreekt die in vivo aanwezig is, is de in vitro invasie test voordelig bij het screenen van vele aandoeningen in korte tijd, terwijl de behoefte aan diermodellen wordt geminimaliseerd. Het doel van deze experimenten is het vergelijken van genexpressie van vermoedelijke oncogenen en het bepalen van de effecten op het gedrag van kankercellen en de agressiviteit van de ziekte met behulp van de in vitro invasie assay en andere tests. Over het algemeen biedt de invasie test consistente, kwantitatieve en snelle resultaten voor het bepalen van gemetastaseerd potentieel, terwijl het ook een relatief goedkope, ongecompliceerde en aanpasbare methode is.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in vitro invasie test is een goedkope, snelle, kwantitatieve en eenvoudige methode voor het bestuderen van de factoren die de invasie van kankercellen bevorderen. Borstkanker is de meest gediagnosticeerde kanker onder vrouwen. Van de drie belangrijkste subtypen van borstkanker, drievoudig negatief, (of er-, PR-, HER2/Neu-), is de meest agressieve, meest waarschijnlijke metastasize, en de meeste dodelijke9. Daarom kan het begrijpen van de genen en expressie die resulteren in metastasen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Grant R15CA169978 van de National Institutes of Health. Aanvullende financiering kwam van de Villanova University.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
Referências
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Pesquisa do Câncer. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Pesquisa do Câncer. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
