O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas
Summary
O ensaio de invasão celular in vitro é utilizado para medir o potencial de metástase oncológica, quantificando o potencial celular para invasão e migração usando inserções de cultura celular contendo matriz proteica. As células são desafiadas a migrar através da matriz proteica e uma membrana porosa, em direção a um quimioatractivo, e depois quantificada por microscopia de luz.
Abstract
O ensaio in vitro da invasão usa uma matriz proteína-rica em uma câmara de Boyden para medir a habilidade de pilhas cultivadas passar através da matriz e de uma membrana porosa em um processo análogo às etapas iniciais da metástase da pilha de cancro. As células testadas podem ser alteradas para a expressão gênica ou tratadas com inibidores para testar alterações no potencial de invasão. Esta experimentação testa o phenotype agressivo das pilhas mamária do tumor do rato para descobrir e caracterizar os oncogenes potenciais que promovem a invasão da pilha. Esta técnica, no entanto, pode ser versátil e adaptada a muitas aplicações diferentes. O experimento em si pode ser feito em um dia e os resultados são adquiridos por microscopia de luz em menos de um dia. Os resultados incluem contagens do número de células invasoras para comparação e análise. O ensaio de invasão in vitro é um método rápido, barato e de corte claro para determinar o comportamento celular em uma cultura que pode ser usada como uma avaliação inicial antes de mais envolvidos em ensaios in vivo.
Introduction
O ensaio in vitro da invasão pode ser uma ferramenta útil ao medir a habilidade de uma pilha de migrar através de uma membrana proteína-revestida, análoga aos primeiros passos na metástase. Uma característica chave de células cancerosas malignas é a sua capacidade de migrar através e invadir tecidos próximos. O cancro que se espalhou ou metástase levanta mais desafios do tratamento e tem umas mais baixas taxas de sobrevivência a longo prazo, quando os tumores localizados forem mais fáceis de tratar e tiverem umas taxas mais elevadas da sobrevivência a longo prazo. Para metástase, as células cancerosas devem deixar o tumor primário e migrar para o sistema circulatório ou linfático, um processo que requer a passagem através da matriz extracelular e da membrana basal1. No processo chamado a transição mesenquimais epithelial (EMT), as pilhas do tumor devem quebrar contatos da pilha-pilha, migrar direccionalmente, e invadir vasos próximos do sangue ou da linfa. As etapas iniciais desta cascata da metástase são do grande interesse desde que estas etapas são o que pode fazer o cancro deadlier. Os fatores genéticos e epigenéticos envolvidos nos primeiros passos da metástase são o foco de uma grande quantidade de pesquisa, mas são necessárias ferramentas experimentais precisas e confiáveis para testar esses primeiros passos tanto in vivo como in vitro.
As ferramentas para medir as alterações na migração celular, como ensaios de cicatrização de feridas (Scratch) ou crescimento em ambientes 3D, como ensaios de agar suave, podem abordar parcialmente a necessidade de métodos experimentais de medir os primeiros passos de metástase, mas um ensaio para medir a invasão é mais desafiador desde que o processo ocorre no corpo dentro de um microambiente complexo do tumor. Para fins de triagem de drogas ou alterações genéticas para determinar fatores importantes na invasão e metástase, um sistema que pode ser usado in vitro com células cultivadas e imitar os desafios enfrentados pelas células metastáticas in vivo é o ensaio de invasão2, a 3. O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente diagnosticado em mulheres e a segunda causa principal de morte por câncer em mulheres, portanto, a compreensão dos genes responsáveis pela invasão de células de câncer de mama e metástase é extremamente importante para a saúde pública. Além disso, as células do rato são um sistema de modelo útil para estudar o cancro da mama e sua progressão.
O ensaio in vitro da invasão é baseado no conjunto da câmara de Boyden onde duas câmaras de meios do crescimento são separadas por uma membrana porosa3. Para imitar o microambiente do tumor, um gel proteína-rico é incluído igualmente para separar pilhas em uma câmara de um chemoattractant no outro e actuar como uma barreira da membrana do porão. A fim migrar para o chemoattractant, as pilhas devem primeiramente passar através da barreira proteína-rica a seguir passam através da membrana porosa-um processo análogo a como as pilhas metastáticas migram através do estroma. O gel rico em proteínas pode ser alterado com base nas necessidades do experimento, mas geralmente consiste em colágeno, ou extrato de membrana basal (por exemplo, Matrigel)4. É uma mistura complexa de proteínas, proteoglicanos e fatores de crescimento, mas consiste principalmente de lamininas e colágeno IV 4,5. As pilhas devem então passar através de uma membrana porosa feita tipicamente do policarbonato, do poliéster, ou do politetrafluoretileno (PTFE). As membranas podem ser compradas comercialmente com ou sem um gel da proteína (tipicamente collagens), ou o gel pode ser comprado separada e adicionado. O tamanho do poro pode ser ajustado com base no tamanho da célula. Quando os tamanhos do pore estiverem disponíveis de 0,4-8,0 μm, somente os poros de 3,0-8,0 μm são grandes bastante para a migração da pilha. O ensaio de invasão tem sido usado para determinar a eficácia dos inibidores sobre a capacidade das células de migrar e invadir. Ao faltar o microambiente exato do tumor que está atual in vivo, o ensaio in vitro da invasão é benéfico em selecionar muitas circunstâncias em um curto período de tempo ao minimizar a necessidade para modelos animais. O objetivo desses experimentos é comparar a expressão gênica de suspeita de oncogenes e determinar os efeitos sobre o comportamento das células cancerosas e a agressividade da doença usando o ensaio de invasão in vitro e outros testes. Globalmente, o ensaio de invasão fornece resultados consistentes, quantitativos e rápidos para determinar o potencial metastático, sendo também um método relativamente barato, direto e adaptável.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de invasão in vitro é um método barato, rápido, quantitativo e direto para estudar os fatores que promovem a invasão de células cancerosas. O câncer de mama é o câncer mais comumente diagnosticado entre as mulheres. Dos três principais subtipos de câncer de mama, triplo negativo, (ou ER-, PR-, HER2/Neu-), é o mais agressivo, mais provável de metástase, e mais mortal9. Portanto, compreender os genes e a expressão que resultam em metástases pode ajudar a encontrar n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão R15CA169978 dos institutos nacionais de saúde. O financiamento adicional veio da Universidade de Villanova.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
Referências
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Pesquisa do Câncer. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Pesquisa do Câncer. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
