안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델
Summary
우리는 기능적인 인간적인 면역 계통 및 안정한 생착한 인간 같이 창자 microbiome를 특징으로 하는 이중 인간화한 BLT 마우스를 생성하기 위한 새로운 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 세균이 없는 마우스 또는 뇨바이오틱 시설에 대한 필요 없이 따를 수 있다.
Abstract
기능성 인간 면역 계통을 특징으로 하는 인간화된 마우스(hu-mice)는 인간 병원체 및 질병에 대한 연구를 근본적으로 변화시켰다. 그(것)들은 인간 또는 그밖 동물 모형에서 공부하는 그렇지 않으면 어렵거나 불가능한 질병을 모델링하기 위하여 이용될 수 있습니다. 창 자 미생물 은 인간의 건강 및 질병에 깊은 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 뮤린 창 자 미생물은 인간에서 발견 하는 것 보다 매우 다른. 생착된 인간 장내 미생물군유전체를 가진 개선된 전임상 후마우스 모델에 대한 필요성이 있다. 따라서, 우리는 인간의 면역 체계와 안정적인 인간 같은 창 자 미생물을 특징으로 하는 이중 hu-마우스를 만들었습니다. 끄 덕. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스는 면역 결핍의 그들의 높은 수준으로 인해 인간화를 위한 최고의 동물 중 하나입니다. 그러나, 세균이 없는 NSG 마우스 및 기타 다양한 중요한 세균 없는 마우스 모델은 현재 시판되고 있지 않다. 또한, 많은 연구 설정은 그놈 바이오 틱 시설에 액세스 할 수 없습니다, 그리고 gnotobiotic 조건에서 작업하는 것은 종종 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 중요한 것은, 세균이 없는 마우스는 세균의 생착 후에도 존재하는 몇몇 면역 성이 결핍이 있습니다. 따라서, 우리는 세균이없는 동물이나 뇨대 생물 시설을 필요로하지 않는 프로토콜을 개발했다. 이중 후 마우스를 생성하기 위해, NSG 마우스는 골수, 간, 흉선 인간화 (hu-BLT) 마우스를 만들기 위해 수술 전에 방사선으로 처리하였다. 마우스는 그 때 기존의 뮤린 창자 미생물군유전체를 고갈시키기 위하여 광범위한 스펙트럼 항생제로 취급되었습니다. 항생제 치료 후, 마우스는 경구 위장을 통해 건강한 인간 기증자 샘플을 가진 배설물 이식을 받았다. 이중 hu-BLT 마우스는 이식된 개별 인간 공여자 샘플에 기초하여 독특한 16S rRNA 유전자 프로파일을 가졌다. 중요한 것은, 이식된 인간-유사 미생물군유전체는 이식 후 최대 14.5주까지의 연구 기간 동안 이중 후-BLT 마우스에서 안정하였다.
Introduction
인간화된 마우스(hu-mice)는 조혈, 면역, 암, 자가면역질환, 전염병 1,2,3, 4를 포함한 인간 건강과 질병의 여러 측면에 대한 연구를 변화시켰습니다. ,5,6,7,8,9. 이러한 후 마우스는 기능적인 인간 면역 계통을 가지고 있고 인간 특정 병원체에 감염될 수 있다는 점에서 다른 마우스 모델에 비해 뚜렷한 이점이 있다. 그럼에도 불구하고, 장내 미생물군유전체의 중요성은 비만, 대사증후군, 염증성 질환, 암10,11,12, 13. 점막 면역 계통 및 창자 microbiome는 창자 및 조직 항상성을 유지하기 위하여 상호 적으로 통제됩니다. 면역 계통은 창자 microbiome에 의해 제출된 항원에 의해 형성되고 면역 계통은 공생 창자 박테리아를 승진시키고 병원체 제거에 있는 중요한 규제 역할을 합니다14,15, 그러나,후마우스의 장내 미생물군유전체는 잘 특성화되지 않았으며, 뮤린 장내 미생물군유전체는인간17과의 조성 및 기능면에서 실질적으로 다르다. 이는 뮤린과 인간의 장 사이의 진화적, 생리적, 해부학적 차이뿐만 아니라 식이요법과 같은 다른 중요한 요인들, 이는 후마우스 질환 모델18의실험 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 따라서, 휴 마우스의 뮤린 창자 미생물군유전체의 분류를 넘어, 생체 내에서 인간 질병의 복잡한 상호 작용을 연구하기 위해 인간 면역 체계와 인간 장내 미생물군유전체를 모두 특징으로 하는 동물 모델이 필요하다.
인간의 과목에서 직접 인간의 질병의 연구는 종종 비실용적이거나 비윤리적이다. 많은 동물 모델은 인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1)과 같은 인간 병원체를 연구하는 데 사용할 수 없습니다. 비 인간 영장류 모형은 유전으로 교배되고, 아주 비싸고, 많은 인간 적인 병원체에 영향을 받기 쉽지 않습니다. 세균이 없고 인간과 같은 장내 미생물군유전체로 재구성된 마우스는 인간의 건강과 질병을 연구하기 위해 널리 사용되고 있다19,20. 그러나, 이러한 동물은 인간의 면역 체계를 가지고 있지 않으며 GF 동물과 함께 일하려면 전문 시설, 절차 및 전문 지식이 필요합니다. 따라서, 장내 미생물군유전체와 인간 면역 계통의 복잡한 관계를 연구하기 위한 개선된 전임상 모델에 대한 필요성이 있다. NOD와 같은 마우스의 많은 변종. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), GF로 상업적으로 사용할 수 없습니다. GF 동물은 또한 미생물21의생착에 의해 완전히 반전되지 않는 오래 지속되는 면역 결핍으로 고통받을 수 있습니다. 따라서, 우리는 기능성 인간 면역 계통 및 특정 병원체 자유로운 (SPF) 조건 의 밑에 안정된 인간 같이 창자 microbiome를 모두 특징으로 하는 이중 hu-마우스를 만들었습니다. 이중 후 마우스를 생성하기 위해, NSG 마우스에서 골수, 간, 흉선 인간화 마우스(hu-BLT)를 생성하기 위한 수술을 수행하였다. hu-BLT 마우스는 그 때 건강한 인간 기증자 견본을 가진 배설물 이식을 광스펙트럼 항생제로 취급하고 그 후에 주어졌습니다. 우리는 45개의 이중 hu-BLT 마우스 및 4개의 인간 배설물 기증자 견본에서 173의 배설물 견본의 세균성 창자 microbiome를 특성화했습니다. 이중 hu-BLT 마우스는 이식되는 개별 적인 인간 공여자 견본에 근거를 둔 독특한 16S rRNA 유전자 단면도가 있습니다. 중요한 것은, 이식된 인간과 같은 미생물군유전체는 이식 후 최대 14.5주까지 연구 기간 동안 마우스에서 안정하였다. 또한, 예측된 메타게놈은 이중 hu-BLT 마우스가 인간 공여자 샘플과 더 유사한 후마우스보다 다른 예측 된 기능 능력을 갖는다는 것을 보여주었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 기능성 인간 면역 계통과 안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체를 특징으로 하는 이중 hu-BLT 마우스의 생성을 위한 것입니다. 이 프로토콜은 GF 동물 및 그놈학적 시설에 대한 필요 없이 다른 인간화 또는 비인간화 마우스 모델에 적응될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 비교적 간단하지만 이중 hu-BLT 마우스의 성공적인 생성에 중요한 몇 가지 중요한 세부 사항이 있습?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BLT 인간화된 마우스 를 생성하는 데 도움을 준 얀민 완, 강구빈, 팔라비 쿤두에게 감사드립니다. 우리는 기능 유전체학 NE-INBRE P20-INBRE P203427-14, 신경 감각 시스템 CoBRE 의 분자 생물학, 프레드 & 파멜라에서 네브래스카 연구 네트워크에서 부분지원을받는 UNMC 유전체학 핵심 시설을 인정하고 싶습니다 버핏 암 센터 – P30CA036727, 뿌리와 뿌리 줄기 혁신 센터 (CRRI) 36-5150-2085-20, 네브래스카 연구 이니셔티브. 우리는 네브래스카 대학 – 링컨 생명 과학 별관과 그들의 도움을 주셔서 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) 교부금 R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 신경 에이즈 (CHAIN) 센터에서 만성 HIV 감염 및 노화에 의해 부분적으로 지원됩니다, 1R01AI111862 Q Li. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 원고 준비 또는 출판 결정에 아무런 역할을하지 않았습니다.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
Referências
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