Un modelo de dos colores BLT humanizados con un microbioma intestinal humano estable y un sistema inmune humano
Summary
Describimos un método novedoso para generar ratones BLT dobles humanizados que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal estable injertado similar al humano. Este protocolo se puede seguir sin necesidad de ratones libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas.
Abstract
Los ratones humanizados (hu-mice) que cuentan con un sistema inmunitario humano funcional han cambiado fundamentalmente el estudio de patógenos humanos y enfermedades. Se pueden utilizar para modelar enfermedades que de otro modo son difíciles o imposibles de estudiar en seres humanos u otros modelos animales. El microbioma intestinal puede tener un profundo impacto en la salud y la enfermedad humanas. Sin embargo, el microbioma intestinal murino es muy diferente al que se encuentra en los seres humanos. Hay una necesidad de modelos preclínicos de hu-mice mejorados que tengan un microbioma intestinal humano injertado. Por lo tanto, creamos doble hu-mice que cuentan con un sistema inmunológico humano y microbioma intestinal humano estable. Cabeceo. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones son uno de los mejores animales para la humanización debido a su alto nivel de inmunodeficiencia. Sin embargo, los ratones NSG libres de gérmenes y varios otros modelos importantes de ratones libres de gérmenes no están disponibles comercialmente. Además, muchos entornos de investigación no tienen acceso a instalaciones gnotobióticas, y trabajar en condiciones gnotobióticas a menudo puede ser costoso y lento. Es importante destacar que los ratones libres de gérmenes tienen varias deficiencias inmunitarias que existen incluso después del injerto de microbios. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo que no requiere animales libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas. Para generar ratones de doble hu, los ratones NSG fueron tratados con radiación antes de la cirugía para crear ratones de médula ósea, hígado, timo humanizados (hu-BLT). Los ratones fueron tratados con antibióticos de amplio espectro para agotar el microbioma intestinal murino preexistente. Después del tratamiento con antibióticos, los ratones recibieron trasplantes fecales con muestras de donantes humanos sanos a través de gavage oral. Los ratones de doble hu-BLT tenían perfiles únicos del gen rRNA 16S basados en la muestra de donante humano individual que fue trasplantada. Es importante destacar que el microbioma trasplantado similar al humano se mantuvo estable en los ratones de doble hu-BLT durante la duración del estudio hasta 14,5 semanas después del trasplante.
Introduction
Los ratones humanizados (hu-mice) han transformado el estudio de muchos aspectos de la salud humana y la enfermedad, incluyendo hematopoyesis, inmunidad, cáncer, enfermedad autoinmune y enfermedad infecciosa1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Estos hu-mice tienen la clara ventaja sobre otros modelos de ratón en que tienen un sistema inmunológico humano funcional y pueden ser infectados con patógenos específicos humanos. Sin embargo, la importancia del microbioma intestinal ha quedado demostrada por su papel en muchas enfermedades humanas como la obesidad, el síndrome metabólico, las enfermedades inflamatorias y el cáncer10,11,12, 13. El sistema inmunitario mucoso y el microbioma intestinal están regulados recíprocamente para mantener la homeostasis intestinal y sistémica. El sistema inmunitario está formado por antígenos presentados por el microbioma intestinal y recíprocamente el sistema inmunitario desempeña un importante papel regulador en la promoción de bacterias intestinales comensales y la eliminación de patógenos14,15, 16. Sin embargo, el microbioma intestinal de hu-mice no se ha caracterizado bien y el microbioma intestinal murino difiere sustancialmente en composición y función de los seres humanos17. Esto se debe a diferencias evolutivas, fisiológicas y anatómicas entre el intestino murino y humano, así como otros factores importantes como la dieta, que pueden influir en los resultados experimentales de los modelos18de la enfermedad de hu-mice. Por lo tanto, más allá de la clasificación del microbioma intestinal murino de hu-mice, se necesita un modelo animal con un sistema inmune humano y microbioma intestinal humano para estudiar las complejas interacciones de la enfermedad humana in vivo.
El estudio de las enfermedades humanas directamente en seres humanos es a menudo poco práctico o poco ético. Muchos modelos animales no se pueden utilizar para estudiar patógenos humanos como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Los modelos de primates no humanos son genéticamente endogámicos, muy caros y no son susceptibles a muchos patógenos humanos. Los ratones que se han derivado como libres de gérmenes (GF) y reconstituidos con microbiomas intestinales similares al humano se han utilizado ampliamente para estudiar la salud humana y la enfermedad19,20. Sin embargo, estos animales no tienen un sistema inmunológico humano y trabajar con animales GF requiere instalaciones especializadas, procedimientos y experiencia. Por lo tanto, hay una necesidad de modelos preclínicos mejorados para estudiar la compleja relación del microbioma intestinal y el sistema inmunitario humano. Muchas cepas de ratones, como NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), no están disponibles comercialmente como GF. Los animales GF también pueden sufrir de deficiencias inmunitarias duraderas que no se invierten completamente por el injerto de microbios21. Por lo tanto, creamos un doble hu-mice con un sistema inmune humano funcional y microbioma intestinal estable similar al humano bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF). Para generar doble hu-mice, se realizó una cirugía en ratones NSG para crear ratones de médula ósea, hígado, timo humanizados (hu-BLT). Los ratones hu-BLT fueron tratados con antibióticos de amplio espectro y luego se les administraron trasplantes fecales con una muestra de donante humano saludable. Caracterizamos el microbioma intestinal bacteriano de 173 muestras fecales de 45 ratones dobles hu-BLT y 4 muestras de donantes fecales humanos. Los ratones de doble hu-BLT tienen perfiles únicos del gen rRNA 16S basados en la muestra de donante humano individual que se trasplanta. Es importante destacar que el microbioma trasplantado similar al humano se mantuvo estable en ratones durante la duración del estudio hasta 14,5 semanas después del trasplante. Además, los metagenomas pronosticados mostraron que los ratones de doble hu-BLT tienen diferente capacidad funcional pronosticada que los ratones de hu que es más similar a las muestras de donantes humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí es para la creación de ratones de doble hu-BLT que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal humano estable. Este protocolo se puede adaptar a otros modelos de ratones humanizados o no humanizados sin necesidad de animales GF e instalaciones gnotobióticas. Si bien los métodos descritos aquí son relativamente simples, hay varios detalles críticos que son importantes para la creación exitosa de ratones de doble hu-BLT. Los ratones NSG son extremadamente inmu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Yanmin Wan, Guobin Kang y Pallabi Kundu por su ayuda en la generación de ratones humanizados BLT. Nos gustaría reconocer el Fondo de Genómica de la UNMC que recibe apoyo parcial de la Red de Investigación de Nebraska en Genómica Funcional NE-INBRE P20GM103427-14, La Biología Molecular de Sistemas Neurosensoriales CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela Buffett Cancer Center – P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, y la Iniciativa de Investigación de Nebraska. Nos gustaría agradecer a la Universidad de Nebraska – Lincoln Life Sciences Annex y a su personal por su asistencia. Este estudio es apoyado en parte por el InstitutoNacional de Salud (NIH) Becas R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li. Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la preparación del manuscrito o la decisión de publicación.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
Referências
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