في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة
Summary
تقدم هنا بروتوكولات لإنشاء الحويصلات أحادية اللاميلار الصغيرة القائمة على الببتيد قادرة على النمو. لتسهيل في إنتاج vesiculo من الببتيد الغشاء، وقد تم تجهيز هذه الحويصلات مع نظام ترجمة النسخ وبلازميد الببتيد ترميز.
Abstract
تجزئة التفاعلات البيوكيميائية هو جانب مركزي من الخلايا الاصطناعية. ولهذا الغرض، تعمل مقصورات التفاعل القائمة على الببتيد كبديل جذاب للدهون أو الحويصلات القائمة على الأحماض الدهنية. خارجيا أو داخل الحويصلات، يمكن التعبير عن الببتيدات بسهولة وتبسيط توليف السلائف الغشاء. كما هو منصوص عليه هنا بروتوكول لإنشاء الحويصلات بأقطار تبلغ حوالي 200 نانومتر استناداً إلى الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) باستخدام الإماهة من الخرز الزجاجي. كما تقدم بروتوكولات للتعبير ELP البكتيرية وتنقية عن طريق ركوب الدراجات في درجة الحرارة العكسية، فضلا عن وظيفية covalent مع الأصباغ الفلورية. وعلاوة على ذلك، يصف هذا التقرير بروتوكولا ً للتمكين من نسخ الحمض النووي الريبي aptamer dBroccoli داخل الحويصلات ELP كمثال أقل تعقيداً لتفاعل كيميائي حيوي. وأخيرا، يتم توفير بروتوكول، والذي يسمح في التعبير vesiculo من البروتينات الفلورية والببتيد الغشاء، في حين أن توليف هذا الأخير يؤدي إلى نمو الحويصلة.
Introduction
عادة ما يتم الاقتراب من إنشاء النظم الخلوية الحية الاصطناعية من اتجاهين مختلفين. في الطريقة من أعلى إلى أسفل ، يتم تقليل جينوم البكتيريا إلى مكوناته الأساسية ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الحد الأدنى من الخلية. في النهج من أسفل إلى أعلى، يتم تجميع الخلايا الاصطناعية دي نوفو من المكونات الجزيئية أو النظم الفرعية الخلوية، والتي تحتاج إلى دمجها وظيفيا في نظام ثابت مثل الخلية.
في نهج دي نوفو، وعادة ما يتحقق تجزئة المكونات البيوكيميائية اللازمة باستخدام الأغشية المصنوعة من الدهون الفوسفاتية أو الأحماض الدهنية1،2،3،4. وذلك لأن أغشية الخلايا “الحديثة” تتكون أساسا من الدهون الفوسفاتية، في حين تعتبر الأحماض الدهنية المرشحين معقولة من حاويات غشاء بريبيوتيك5،6. لتشكيل أغشية جديدة أو لتسهيل نمو الغشاء، يجب توفير كتل البناء amphiphilic من الخارج7 أو من الناحية المثالية من خلال الإنتاج داخل مقصورة membranous باستخدام عمليات الابتنائية المقابلة4 ،8.
في حين أن تخليق الدهون هو عملية التمثيل الغذائي معقدة نسبيا، يمكن أن تنتج الببتيدات بسهولة جدا باستخدام ردود الفعل التعبير الجيني خالية من الخلايا9،10. وبالتالي، فإن أغشية الببتيد التي شكلتها الببتيدات amphiphilic تمثل بديلا للاهتمام للأغشية الدهنية كما مرفقات لتقليد الخلايا الاصطناعية التي هي قادرة على النمو11.
البوليمرات المركبة التي تشبه الإيلاستين أمفيفيليك (ELPs) هي فئة جذابة من الببتيدات، والتي يمكن أن تكون بمثابة لبنة البناء لمثل هذه الأغشية12. عزر تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية من ELPs هو (GaGVP)ن، حيث “أ” يمكن أن يكون أي حمض أميني باستثناء برولين و “ن” هو عدد من عزر يكرر13،14،15،16،17 . وقد تم إنشاء ELPs مع كتلة الكارهة للماء التي تحتوي أساسا فينيلألانين لكتلة وhydrophilic تتألف أساسا من حمض الجلوتاميك11. اعتمادا على المعلمات والحل، مثل درجة الحموضة وتركيز الملح، ELPs تظهر ما يسمى انتقال درجة الحرارة العكسية في درجة الحرارة TT، حيث تخضع الببتيدات للانتقال مرحلة قابلة للعكس تماما من الماء إلى الكاره للماء الدوله. يمكن تنفيذ تركيب الببتيدات بسهولة داخل الحويصلات باستخدام “TX-TL” استخراج الخلايا البكتيرية11،18،19،20،21،الذي يوفر جميع المكونات اللازمة لردود الفعل النسخ والترجمة المقترنة.
تم تغليف نظام TX-TL معا، مع قالب الحمض النووي ترميز ELPs في الحويصلات ELP باستخدام الجفاف الإماهة من الخرز الزجاجي كدعم قوي. تشكيل الحويصلات يحدث من خلال الإماهة من الببتيدات المجففة من سطح حبة11. ويمكن استخدام أساليب أخرى22 لتكوين الحويصلات، والتي يحتمل أن تظهر أقل تشتت وأحجام الحويصلة أكبر (على سبيل المثال، تشكيل الكهربائية، نقل مرحلة مستحلب، أو الأساليب القائمة على microfluidics). لاختبار صلاحية طريقة التغليف، يمكن استخدام نسخ من dBroccoli aptamer الفلورية23 بدلاً منذلك 11، وهو أقل تعقيداً من التعبير الجيني مع نظام TX-TL.
بسبب التعبير عن كتل بناء الغشاء في vesiculo وتأسيسها في وقت لاحق في الغشاء ، تبدأ الحويصلات في النمو11. ويمكن إثبات دمج غشاء ELPs من خلال فحص افري. ولهذه الغاية، تترافق الـ ELPs المستخدمة في تكوين مجموعة الحويصلات الأولية مع الأصباغ الفلورية بحصص متساوية تشكل زوجاً من الـ FRET. عند التعبير عن ELPs غير المسمى في vesiculo ودمجها في الغشاء ، يتم تخفيف ELPs المسمى في الغشاء وبالتالي فإن إشارة FRET تنخفض11. كطريقة متعددة الاستخدامات وشائعة للاقتران، يتم استخدام النحاس المحفز ة أزيد-ألكين سيكلوكسيدو. مع استخدام الرباط استقرار مثل تريس (البنزلتريازولميثيل) أمين، يمكن أن يتم رد الفعل في محلول مائي في درجة الحموضة الفسيولوجية دون تحلل التحلل من المتفاعلين11، وهو مناسب لتفاعلات الاقتران التي تنطوي على الببتيدات.
ويقدم البروتوكول التالي وصفاً مفصلاً للإعداد لزراعة الببتيدوسومات القائمة على ELP. يتم وصف التعبير عن الببتيدات وتشكيل الحويصلة باستخدام طريقة الخرز الزجاجي. وعلاوة على ذلك، يتم وصف كيفية تنفيذ نسخ من البروكلي الفلورية aptamer ورد الفعل النسخ الترجمة للتعبير عن البروتين داخل الحويصلات ELP. وأخيرا، شريطة هو إجراء لاقتران ELPs مع الفلوروفور، والتي يمكن استخدامها لإثبات نمو الحويصلة من خلال فحص فريت11.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإماهة الفيلم هو إجراء شائع لخلق الحويصلات يونيلاميلار الصغيرة. المصدر الرئيسي للفشل هو التعامل الخاطئ مع المواد المستخدمة في الإجراء.
في البداية، يتم إنتاج ELPs من قبل خلايا القولونية E. . العائد بعد تنقية ELP يمكن أن تختلف اختلافا كب…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعرب عن امتناننا للدعم المالي من خلال DFG TRR 235 (ظهور الحياة، المشروع P15)، ومجلس البحوث الأوروبي (اتفاق المنحة رقم 694410 AEDNA)، وكلية الدراسات العليا الدولية للعلوم والهندسة في TUM IGSSE (المشروع رقم 9.05) . نشكر إي فالغنهاور على مساعدتها في إعداد العينات. نشكر أ. دوبين وم. شوارتز شيلينغ على مساعدتهما في نظام TX-TL والمناقشات المفيدة. نشكر ن. ب. هولاند على المناقشات المفيدة.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
Referências
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -. S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
