הציגו כאן הם פרוטוקולים ליצירת פפטיד מבוסס unilamellar שלפוחיות קטנות מסוגל לצמיחה. כדי להקל על ייצור vesiculo של פפטיד הממברנה, אלה שלפוחיות מצוידות עם תמלול-תרגום מערכת ו-פפטיד קידוד פלמיד.
מידור של תגובות ביוכימית הוא היבט מרכזי של תאים סינתטיים. למטרה זו, פפטיד מבוססי תאים התגובה לשמש חלופה אטרקטיבית ליפוזומים או חומצת שומן מבוססי שלפוחיות. מבחוץ או בתוך שלפוחיות, פפטידים יכולים להתבטא בקלות ולפשט את הסינתזה של ממברנה מקדים. בתנאי זה הוא פרוטוקול ליצירת ושלפוחיות עם קטרים של ~ 200 ננומטר מבוסס על לאלסטין האמפיפיפילית כמו פוליפפטידים (למשל) ניצול התייבשות-לחות מחרוזי זכוכית. כמו כן מוצגים פרוטוקולים לביטוי וטיהור בקטריאלי באמצעות הטמפרטורה ההופכית רכיבה על אופניים, כמו גם הפונקציונליזציה שלהם עם צבעי פלורסנט. יתר על כן, דו ח זה מתאר פרוטוקול כדי לאפשר את שעתוק ה-RNA aptamer אלף dBroccoli רוקולי בתוך שלפוחית הצער כדוגמה מורכבת פחות עבור תגובה ביוכימית. לבסוף, פרוטוקול מסופק, אשר מאפשר vesiculo ביטוי של חלבונים פלורסנט ואת פפטיד ממברנה, בעוד סינתזה של התוצאות האחרונות צמיחת veלפוחית.
בדרך כלל מתקרבים ליצירת מערכות סלולריות מהחי הסינתטי משני כיוונים שונים. בשיטה מלמעלה למטה, הגנום של חיידק מופחת לרכיבים החיוניים שלו, בסופו של דבר מוביל לתא מינימלי. בגישה מלמטה-למעלה, תאים מלאכותיים מורכבים דה נובו מרכיבים מולקולריים או מערכות משנה סלולרית, אשר צריך להיות משולבים באופן פונקציונלי לתוך מערכת עקבית כמו תא.
בגישה דה נובו, מידור של הרכיבים הביוכימיים הנחוצים מושגת בדרך כלל באמצעות ממברנות העשויים פוספוליפידים או חומצות שומן1,2,3,4. הסיבה לכך היא “מודרני” ממברנות תא מורכב בעיקר פוספוליפידים, בעוד חומצות שומן נחשבים מועמדים סביר של מארזים ממברנה preביוטית5,6. עבור היווצרות של ממברנות חדשים או כדי להקל על גידול ממברנה, אבני בניין אמפיפילי חייב להיות מסופק מן החיצוני7 או אידיאלי באמצעות ייצור בתוך תא קרומי באמצעות תהליכים אנבוליים המקביל4 ,8.
בעוד סינתזה השומנים הוא תהליך מטבולית יחסית מורכב, פפטידים יכולים להיות מיוצר בקלות באמצעות תא-חינם ביטוי גנים תגובות9,10. מכאן, ממברנות פפטיד הנוצר על ידי פפטידים אמפיפילי מייצגים חלופה מעניינת לממברנות שומנים כמו מארזים עבור מחקה תא מלאכותי כי הם מסוגלים לצמוח11.
אלסטין (ELPs) בצורת בלוק-בלוקים (אלפס) הם מעמד אטרקטיבי של פפטידים, אשר יכולים לשמש כאבן בניין לקרומים כגון12. המוטיב הבסיסי של חומצה אמינית של elps הוא (gagvp)n, שם “a” יכול להיות כל חומצה אמינית למעט פרולין ו-“n” הוא מספר המוטיב חוזר13,14,15,16,17 . ELPs נוצרו עם בלוק הידרופובי המכיל בעיקר פנילאלנין עבור בלוק הידרופילי מורכב בעיקר של חומצה גלוטמית11. בהתאם לפרמטרים פתרון, כגון הריכוז pH ו מלח, ELPs התערוכה שנקרא טמפרטורה הופכי מעבר בטמפרטורה Tt, שבו הפפטידים עוברים מעבר שלב הפיך לחלוטין מן הידרופילי כדי הידרופובי מדינה. סינתזה של פפטידים ניתן ליישם בקלות בתוך שלפוחיות באמצעות “TX-TL” תא חיידקי לחלץ11,18,19,20,21, אשר מספק כל הרכיבים הנחוצים לשילוב תגובות שעתוק ותרגום.
מערכת ה-TX-TL הייתה מחולקת יחד, כאשר הקידוד של תבנית ה-DNA מגיע לתוך שלפוחית הידיים באמצעות התייבשות-מחדש מחרוזי זכוכית כתמיכה מוצקה. היווצרות של שלפוחיות מתרחשת באמצעות הסבה של הפפטידים היבשים מן המשטח חרוז11. שיטות נוספות22 עבור היווצרות שלפוחית לפוחית ניתן להשתמש, אשר עשוי להראות בגודל נמוך יותר וגדלים שלפוחית גדולה יותר (למשל, אלקטרו היווצרות, אמולסיה שלב העברת, או מיקרופלואידיקה שיטות מבוססות). כדי לבדוק את הכדאיות של שיטת עטיפת הגוף, שעתוק ברוקולי הפלואורוגנטי של ה-23 ניתן לחילופין להשתמש ב-11, שהוא מורכב פחות מביטוי גנטי עם מערכת TX-TL.
בשל ביטוי של ממברנה אבני בניין ב vesiculo ואת ההתאגדות הבאים שלהם לתוך קרום, שלפוחיות להתחיל לגדול11. התאגדות ממברנה של ELPs ניתן להדגים באמצעות שיטת הסריג. לשם כך, ELPs המשמש להקמת האוכלוסייה הראשונה שלפוחית השמש מצויישים עם צבעי פלורסנט במניות שוות המהווים זוג מסוג סריג. עם ההבעה של ELPs לא מתויג ב vesiculo התאגדות שלהם לתוך הקרום, ELPs מתויג בקרום מדולל וכתוצאה מכך האות הסריג מקטין11. כשיטה מגוונת ומשותפת לקוניוגציה, משתמשים בתוספת שימוש בנחושת מזרז לשימוש. עם השימוש בליגמים ייצוב וכגון טריס (בנזיל)-אמין, התגובה יכולה להתבצע בתמיסה מימית ב-pH פיזיולוגי ללא הידרוליזה של המגיבים11, אשר מתאים לתגובות בניינים מעורבים בפפטידים
הפרוטוקול הבא מציג תיאור מפורט של ההכנות לגידול peptidosomes המבוססים על. הביטוי של פפטידים ושלפוחית היווצרות באמצעות שיטת חרוזי זכוכית מתוארים. כמו-כן, הוא מתאר כיצד ליישם שעתוק של הברוקולי הפלואורוגנטי ותגובת התרגום לביטוי חלבון בתוך שלפוחית הדיבור. לבסוף, בתנאי הוא הליך עבור הקוניוגציה של ELPs עם fluorophores, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להוכיח צמיחה שלפוחית באמצעות שיטת סריג11.
חידוש הסרט הוא הליך נפוץ ליצירת unilamellar שלפוחיות קטנות. המקור העיקרי לכישלון הוא טיפול שגוי של החומרים המשמשים בהליך.
בתחילה, the ELPs מיוצרים על ידי E. coli תאים. התשואה לאחר טיהור שלום יכולה להשתנות באופן משמעותי בהתאם לאופן הפעולה הקפדני…
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים את התמיכה הפיננסית באמצעות DFG TRR 235 (הופעתה של החיים, פרויקט P15), מועצת המחקר האירופית (הסכם הענקת no. 694410 AEDNA), ואת הספר הבינלאומי של טום בוגרת למדעים והנדסה IGSSE (פרויקט מס ‘ 9.05) . אנו מודים לא פאלגנאואר על עזרתה בהכנה לדוגמא. אנו מודים לגבי א. דבין ו-M. שוורץ-שילינג על עזרתם עם מערכת TX-TL ודיונים שימושיים. אנו מודים לנ. ב. הולנד על דיונים שימושיים.
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
DNase I | NEB | M0303S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
methanol | Carl Roth | 82.2 | |
MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
rNTP | NEB | N0466S | |
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
T7 polymerase | NEB | M0251S | |
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 |