Hier werden Protokolle zur Herstellung von peptidbasierten kleinen unilamellalaren Vesikeln vorgestellt, die wachstumsfähig sind. Um die Vesiculo-Produktion des Membranpeptids zu erleichtern, sind diese Vesikel mit einem Transkriptions-Translation-System und dem Peptid-kodierenden Plasmid ausgestattet.
Die Abteilisierung biochemischer Reaktionen ist ein zentraler Aspekt synthetischer Zellen. Zu diesem Zweck dienen Peptid-basierte Reaktionsfächer als attraktive Alternative zu Liposomen oder fettsäurebasierten Vesikeln. Äußerlich oder innerhalb der Vesikel können Peptide leicht exprimiert werden und vereinfachen die Synthese von Membranvorläufern. Hier ist ein Protokoll zur Herstellung von Vesikeln mit Durchmessern von 200 nm auf Basis der amphiphilen Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) unter Verwendung von Dehydrierung-Rehydratation aus Glasperlen vorgesehen. Ebenfalls vorgestellt werden Protokolle zur bakteriellen ELP-Expression und -Reinigung über inverseS Temperaturzyklierung sowie deren kovalente Funktionalisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht ein Protokoll, das die Transkription von RNA-Aptamer dBroccoli in ELP-Vesikeln als weniger komplexes Beispiel für eine biochemische Reaktion ermöglicht. Schließlich wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, das die Vesiculo-Expression von fluoreszierenden Proteinen und dem Membranpeptid ermöglicht, während die Synthese des letzteren zu einem Vesikelwachstum führt.
Die Schaffung von synthetischen lebenden zellulären Systemen wird in der Regel aus zwei verschiedenen Richtungen angegangen. Bei der Top-Down-Methode wird das Genom eines Bakteriums auf seine wesentlichen Bestandteile reduziert, was letztlich zu einer minimalen Zelle führt. Im Bottom-up-Ansatz werden künstliche Zellen de novo aus molekularen Komponenten oder zellulären Subsystemen zusammengesetzt, die funktional in ein konsistentes zellähnliches System integriert werden müssen.
Im de novo-Ansatz wird die Kompartimentierung der notwendigen biochemischen Komponenten in der Regel mit Membranen aus Phospholipiden oder Fettsäuren1,2,3,4erreicht. Denn “moderne” Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden, während Fettsäuren als plausible Kandidaten präbiotischer Membrangehäuse5,6gelten. Zur Bildung neuer Membranen oder zur Erleichterung des Membranwachstums müssen amphiphile Bausteine von außen7 oder idealerweise durch die Produktion innerhalb eines membranösen Fachs mit den entsprechenden anabolen Verfahren 4 ,8.
Während die Lipidsynthese ein relativ komplexer Stoffwechselprozess ist, können Peptide recht leicht mit zellfreien Genexpressionsreaktionen9,10produziert werden. Daher stellen Peptidmembranen, die durch amphiphile Peptide gebildet werden, eine interessante Alternative zu Lipidmembranen als Gehäuse für künstliche Zellmimiks dar, die11wachsen können.
Amphiphile Elastin-ähnliche Diblock-Copolymere (ELPs) sind eine attraktive Klasse von Peptiden, die als Baustein für solche Membranen dienen können12. Das grundlegende Aminosäuresequenzmotiv von ELPs ist (GaGVP)n, wobei “a” eine beliebige Aminosäure außer Prolin und “n” die Anzahl der Motivwiederholungen13,14,15,16,17 . ELPs wurden mit einem hydrophoben Block erstellt, der hauptsächlich Phenylalanin für a enthält, und einem hydrophilen Block, der hauptsächlich aus Glutaminsäurebesteht 11. Je nach A- und Lösungsparametern wie pH- und Salzkonzentration weisen ELPs einen sogenannten inversen Temperaturübergang bei Temperatur Ttauf, bei dem die Peptide einen vollständig reversiblen Phasenübergang von einem hydrophilen zu hydroben zustand. Die Synthese der Peptide kann einfach in Vesikelmit dem Bakterienzellextrakt “TX-TL” implementiert werden11,18,19,20,21, alle notwendigen Komponenten für gekoppelte Transkriptions- und Übersetzungsreaktionen.
Das TX-TL-System wurde zusammengekapselt, wobei die DNA-Vorlage die ELPs in ELP-Vesikel kodiert, wobei die Dehydrierung-Rehydratation von Glasperlen als feste Stütze verwendet wird. Die Bildung von Vesikel n.A. erfolgt durch Rehydrierung der getrockneten Peptide von der Perlenoberfläche11. Es können andere Methoden22 zur Vesikelbildung eingesetzt werden, die möglicherweise eine geringere Polydispersität und größere Vesikelgrößen aufweisen (z. B. Elektrobildung, Emulsionsphasentransfer oder mikrofluidische Verfahren). Zur Prüfung der Lebensfähigkeit der Verkapselungsmethode kann alternativ die Transkription des fluorogenen Aptamers dBroccoli23 verwendet werden11, was weniger komplex ist als die Genexpression mit dem TX-TL-System.
Durch die Expression der Membranbausteine in vesiculo und deren anschließende Einbindungin die Membran beginnen die Vesikel 11 zu wachsen. Die Membranintegration der ELPs kann durch einen FRET-Assay nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck werden die ELPs, die für die Bildung der ursprünglichen Vesikelpopulation verwendet werden, mit fluoreszierenden Farbstoffen in gleichen Teilen konjugiert, die ein FRET-Paar bilden. Bei Expression von nicht gekennzeichneten ELPs in vesiculo und deren Einbau in die Membran werden die beschrifteten ELPs in der Membran verdünnt und damit das FRET-Signal um11abgenommen. Als vielseitige und gängige Methode zur Konjugation wird kupferkatalysierte Azid-Alkyn-Zyklusverwendet verwendet. Mit der Verwendung eines stabilisierenden Liganden wie Tris (Benzyltriazolylmethyl)-amin kann die Reaktion in einer wässrigen Lösung bei einem physiologischen pH-Wert ohne Hydrolyse von Reaktanten11durchgeführt werden, die für Konjugationsreaktionen geeignet ist. Peptide.
Das folgende Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung für wachsende ELP-basierte Peptidosomen. Die Expression der Peptide und vesikelbildung mit der Glasperlenmethode werden beschrieben. Darüber hinaus wird beschrieben, wie die Transkription des fluorogenen dBroccoli Aptamers und die Transkriptions-Translation-Reaktion für die Proteinexpression innerhalb der ELP-Vesikel implementiert werden kann. Schließlich ist ein Verfahren für die Konjugation von Elp mit Fluorophoren vorgesehen, das verwendet werden kann, um das Vesikelwachstum durch einen FRET-Assay11nachzuweisen.
Filmrehydratation ist ein gängiges Verfahren zur Herstellung von kleinen unilamellalaren Vesikeln. Die Hauptursache des Versagens ist die falsche Handhabung der im Verfahren verwendeten Materialien.
Zunächst werden die ELPs von E. coli-Zellen produziert. Die Ausbeute nach der ELP-Reinigung kann je nachdem, wie sorgfältig das Protokoll während seiner entscheidenden Schritte durchgeführt wird, erheblich variieren. …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken der finanziellen Unterstützung durch die DFG TRR 235 (Emergence of Life, Projekt P15), den European Research Council (Fördervertrag Nr. 694410 AEDNA) und die TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (Projekt Nr. 9.05) . Wir danken E. Falgenhauer für ihre Hilfe bei der Probenvorbereitung. Wir danken A. Dupin und M. Schwarz-Schilling für ihre Hilfe beim TX-TL System und nützliche Diskussionen. Wir danken N. B. Holland für die nützlichen Diskussionen.
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
DNase I | NEB | M0303S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
methanol | Carl Roth | 82.2 | |
MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
rNTP | NEB | N0466S | |
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
T7 polymerase | NEB | M0251S | |
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 |