توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في Caenorhabditis elegans
Summary
يصف هذا العمل طريقة قوية ومباشرة للكشف عن وقياس الإندوكانابينويد 2-أرشيدونويلغليسيرول (2-AG) في C. elegans. معيار تحليلي مُعدّ نُستخدم للتكّنّال من 2-AG بواسطة التخفيف النظائري والقياس اللوني السائل – الرذاذ الكهربائي -قياس الطيف الكتلي الترادف (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
يقدم هذا العمل طريقة لإعداد معيار تحليلي لتحليل 2-arashidonoyl الجلسرين (2-AG) نوعيا وكميا عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة-الكهربائي التأين-جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-ESI-MS/MS). يتم حفظ Endocannabinoids وسطاء الدهون التي تنظم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. في C. elegans, تم العثور على 2-AG لامتلاك أدوار مختلفة, بما في ذلك تعديل تشكيل دور والتمثيل الغذائي الكولسترول. يصف هذا التقرير طريقة للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكاليف واستقرار المعايير المبتورة المطلوبة للقياس الكمي 2-AG. إجراء توليف المعيار بسيط ويمكن القيام به في أي مختبر، دون الحاجة إلى الخبرة التوليفية العضوية أو المعدات الخاصة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف تعديل طريقة فولتش لاستخراج المعيار المبتور من ثقافة C. elegans. وأخيرا، يتم وصف طريقة كمية وتحليلية للكشف عن 2-AG باستخدام مستقرة isotopically المسمى التناظرية 1-AG-D5، والذي يوفر نتائج موثوق بها في تشغيل الكروماتوغرافية السريعة. هذا الإجراء مفيد لدراسة الأدوار المتعددة من 2-AG في C. elegans في حين يجري أيضا تنطبق على دراسات أخرى من الأيض في الكائنات الحية المختلفة.
Introduction
Endocannabinoids تنظيم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ويتم حفظها وسطاء الدهون1. أول الإندوكانابينويدات المكتشفة والأكثر تميزا هي أنانداميد (أرشيدونويلإيثانولاميد، AEA) و 2-أرشيدونويل الجلسرين (2-AG). Endocannabinoids تلعب العديد من الأدوار الحاسمة, بما في ذلك تلك المشاركة في نظم مكافأة الدماغ، فضلا عن إدمان المخدرات, الذاكرة, المزاج, والعمليات الأيضية2. يتم تصنيع AEA و 2-AG فقط عند الحاجة ولها فترات حياة قصيرة، ويتم تدهورها من خلال نقل البروتين التناول والتحلل المائي3.
أصبح استخدام النماذج الحيوانية مثل Caenorhabditis elegans (C. elegans)مهملدراسة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية بما في ذلك المبرمج، إشارات الخلايا، دورة الخلية، قطبية الخلايا، تنظيم الجينات، التمثيل الغذائي، الشيخوخة، وتحديد الجنس4،5. بالإضافة إلى ذلك، C. elegans هو نموذج ممتاز لدراسة الأدوار الفسيولوجية للأحماض الدهنية غير المشبعة (PUFAs). وقد تم تحديد AEA في C. elegans ويتم تخفيض تحت القيود الغذائية6. هذا النقص يمتد عمر الديدان الخيطية من خلال آلية تقييد الغذائية التي يمكن قمعها عن طريق مكملات مع endocannabinoid. في الآونة الأخيرة، تم اكتشاف أن 2-AG وAEA تلعب أدوارا أساسية في تنظيم الاتجار الكولسترول في C. elegans7. والأهم من ذلك، تم تحديد أن المكملات الغذائية مع الخارجية 2-AG يمكن إنقاذ dauer اعتقال، والذي يسببه ضعف الكولسترول الاتجار في نيمان بيك نوع C1 C. elegans المسوخ.
للحصول على فهم أفضل لعلاقة 2-AG مع الاتجار بالكولسترول والعمليات البيولوجية الأخرى في الديدان الخيطية (أي الإشارات أحادية الأمينية، nociception والحركة)، فمن الأهمية بمكان لدراسة هذا المستقلب الذاتية وكيف هو تتأثر في ظل بعض الظروف البيئية والغذائية8،9،10،11،12،13. لذلك، لا بد من تصميم وتحسين طريقة للكشف عن وتحديد المحلي 2-AG في C. elegans التي هي بسيطة للاستخدام للعلماء من مختلف المجالات، وخاصة أولئك الذين يدرسون سلوك الديدان الخيطية فيما يتعلق بهذا إندوكانابينويد.
في عام 2008، نجح Lethonen وزملاء العمل في تحديد 2-AG وAEA في C. elegans باستخدام LC-MS الأساليب التحليلية14. في عام 2011، تمكنوا من توسيع هذه التقنية إلى endocannabinoids أخرى15. وقد أظهرت الأعمال الحديثة أساليب تحليلية أخرى نجحت في الكشف عن والتحديد الكمي للبطانة في C. elegans، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي وGC-MS16،17،18، وقد كما أفيد أنه يمكن توسيع أساليب تحليلية مماثلة إلى نماذج أخرى19.
وعادة ما تنطوي الأساليب التحليلية المبلغ عنها سابقاً المستخدمة في التحديد الكمي 2-AG في العينات البيولوجية على استخدام معايير مقنَّعة يتم الحصول عليها تجارياً وتتطلب توافرها للشراء20و21. العديد من المعايير التحليلية للقياس الكمي LC-MS/MS من endocannabinoids متاحة تجاريا من مقدمي مختلف. ومع ذلك، فهي مكلفة، وحساسة، وتصبح مؤكسدة مع مرور الوقت، وذلك بسبب وجود سندات مزدوجة متعددة. وتستند الإصدارات الأكثر شيوعا من هذه المعايير على حمض الأراكيدوليك ثماني ة deuterated ومناسبة للقياس الكمي عن طريق تخفيف النظائر LC-MS/MS14،22. أيضا، يتم استبدال معظم هذه المعايير في موقف 2 من الجلسرين، مما يجعلها غير مستقرة في ظل معظم الظروف لأنها عرضة للهجرة أسيل19،23.
للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكاليف واستقرار هذه المعايير deuterated، يتم تقديم طريقة مريحة وبسيطة لإعداد معيار تحليلي على أساس الجلسرين د5. تسلسل لإعداد معيار خماسي ة deuterated يتطلب إجراء من ثلاث خطوات التي تؤدي إلى معيار 1-AG-D5, وهو مستقر ولا يخضع للهجرة أسيل (القضية الرئيسية عندما تهدف إلى توليف 2-monoacylglycerols).
الهدف الرئيسي هنا هو إظهار طريقة بسيطة واستنساخ لدراسة 2-AG في C. elegans، بما في ذلك توليف المعايير التحليلية deuterated، وإعداد واستخراج عينات الديدان الخيطية، والتحليل من قبل LC-MS /MS(الشكل 1 ). هذا الإجراء التركيبي يمكن تحقيقه دون المعرفة التوليفية العضوية المتطورة أو المعدات الخاصة، مما يجعلها مناسبة للعلماء من مختلف المجالات الذين يدرسون سلوك C. elegans تحت تأثير endocannabinoid. كما يمكن توسيع هذه الطريقة لتشمل نماذج دراسية أخرى، مما يجعلها مفيدة لمختلف الأهداف. وقد تم تطبيق المعيار، الذي تم إعداده كما هو ذكر هنا، لتطوير طريقة كروماتوغرافية سريعة وموثوق بها تسمح بالكشف الفعال والقياس الكمي لـ 2-AG بطريقة قابلة للاستنساخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endocannabinoids هي فئة من الدهون التي تورطت في تنظيم تشكيل دور في C. elegans7. وبشكل أكثر تحديدا، فإن تركيب الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) مهم للاتجار بالكوليسترول والتنمية الإنجابية للدانة. وقد كشف هنا أن 2-AG، وهو حمض الأراكيدونيك الذي يحتوي على endocannabinoid، هو المسؤول عن ار?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة بحثية من المعهد الوطني للعلوم العلمية والتكنولوجية (ANPCyT, PICT 2014-3693). جي إف دي إل، جي بي، و بي إتش سي هم زملاء من كونيست. دي دي إم وجي آر إل عضوان في مهنة البحث في كونيست. نحن ممتنون لغونزالو لامبرتو (INMET) لتحليل LC-MS/MS والمناقشة المفيدة. وقد قام بتصوير وتحرير الفيديو راميرو أورتيغا وماريا سوليداد كاساسولا من إدارة العلوم في جامعة العلوم، كلية العلوم العقلية للجامعة الوطنية في روزاريو، الأرجنتين.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
Referências
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
