Síntesis de un estándar deuterated para la cuantificación de 2-Arachidonoylglycerol en Caenorhabditis elegans
Summary
Este trabajo describe un método robusto y sencillo para detectar y cuantificar el endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) en C. elegans. Un estándar analítico deuterado nos preparó y utilizó para la cuantificación de 2-AG por dilución isotópica y cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Este trabajo presenta un método para preparar un estándar analítico para analizar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) cualitativa y cuantitativamente mediante cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS). Los endocannabinoides son mediadores de lípidos conservados que regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos. En C. elegans,2-AG se ha encontrado que poseen diferentes funciones, incluyendo la modulación de la formación de dauer y el metabolismo del colesterol. Este informe describe un método para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de las normas deuteradas necesarias para la cuantificación de 2 AG. El procedimiento para la síntesis de la norma es simple y se puede realizar en cualquier laboratorio, sin necesidad de experiencia en síntesis orgánica o equipo especial. Además, se describe una modificación del método de Folch para extraer el estándar deuterated de la cultura C. elegans. Por último, se describe un método cuantitativo y analítico para detectar 2-AG utilizando el análogo 1-AG-d5 etiquetado isotópicamente estable, que proporciona resultados fiables en una ejecución cromatográfica rápida. El procedimiento es útil para estudiar las múltiples funciones de 2-AG en C. elegans mientras que también es aplicable a otros estudios de metabolitos en diferentes organismos.
Introduction
Los endocannabinoides regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos y se conservan mediadores de lípidos1. Los primeros endocannabinoides descubiertos y más bien caracterizados son anandamida (arachidonoylethanolamida, AEA) y 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Los endocannabinoides juegan muchos papeles críticos, incluyendo los involucrados en los sistemas de recompensa cerebral, así como la adicción a las drogas, memoria, estado de ánimo, y procesos metabólicos2. AEA y 2-AG sólo se sintetizan cuando es necesario y tienen una vida útil corta, y se degradan a través de la retoma de proteínas de transporte y la hidrólisis3.
El uso de modelos animales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) se ha convertido en importante para estudiar la gran variedad de procesos biológicos incluyendo apoptosis, señalización celular, ciclo celular, polaridad celular, regulación genética, metabolismo, envejecimiento, y determinación del sexo4,5. Además, C. elegans es un excelente modelo para estudiar las funciones fisiológicas de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). AEA se ha identificado en C. elegans y se reduce bajo restricción dietética6. Esta deficiencia extiende la vida útil del nematodo a través de un mecanismo de restricción dietética que puede ser suprimido por la suplementación con el endocannabinoide. Recientemente, se descubrió que 2-AG y AEA desempeñan un papel fundamental en la regulación del tráfico de colesterol en C. elegans7. Más importante aún, se determinó que la suplementación con 2-AG exógeno puede rescatar el arresto de Dauer, que es causado por el deterioro del tráfico de colesterol en Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.
Para comprender mejor la relación de 2-AG con el tráfico de colesterol y otros procesos biológicos en el nematodo (es decir, señalización monoaminérgica, nocicepción y locomoción), es crucial estudiar este metabolito endógeno y cómo es afectados en determinadas condiciones ambientales y dietéticas8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, es imperativo diseñar y optimizar un método para detectar y cuantificar las 2-AG endógenas en C. elegans que sea fácil de usar para científicos de diferentes campos, especialmente aquellos que estudian el comportamiento del nematodo en relación con esto Endocannabinoide.
En 2008, Lethonen y sus compañeros de trabajo lograron identificar 2-AG y AEA en C. elegans utilizando los métodos analíticos de LC-MS14. En 2011, lograron expandir esta técnica a otros endocannabinoides15. Trabajos más recientes han mostrado otros métodos analíticos que han tenido éxito en la detección y cuantificación de endocannabinoides en C. elegans,incluyendo espectrometría de masas y GC-MS16,17,18, y ha también se ha informado de que métodos analíticos similares pueden ampliarse a otros modelos19.
Los métodos analíticos previamente notificados utilizados para cuantificar 2-AG en muestras biológicas suelen implicar el uso de normas deuterated que se adquieren comercialmente y requieren disponibilidad para la compra20,21. Muchos estándares analíticos para la cuantificación LC-MS/MS de endocannabinoides están disponibles comercialmente de diferentes proveedores. Sin embargo, son caros, son sensibles y se oxidan con el tiempo, debido a la presencia de múltiples enlaces dobles. Las versiones más comunes de estas normas se basan en el ácido araquidónico octa-deuterated y son adecuadas para la cuantificación mediante dilución isótopo LC-MS/MS14,22. Además, la mayoría de estas normas se sustituyen en la posición 2 del glicerol, haciéndolos inestables en la mayoría de las condiciones, ya que son propensos a la migración de acilo19,23.
Para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de estas normas deuteradas, se presenta un método conveniente y sencillo para preparar un estándar analítico basado en glicerol-d5. La secuencia para preparar la norma penta-deuterated requiere un procedimiento de tres pasos que da como resultado el estándar 1-AG-d5, que es estable y no se somete a migración de acil (el problema principal cuando se pretende sintetizar 2-monoacilglycerols).
El objetivo principal aquí es mostrar un método simple y reproducible para estudiar 2-AG en C. elegans, incluyendo la síntesis del estándar deuterated analítico, la preparación y extracción de las muestras de nematodos, y el análisis por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimiento sintético es alcanzable sin el sofisticado conocimiento de síntesis orgánica o equipo especial, por lo que es adecuado para científicos de diferentes campos que están estudiando el comportamiento de C. elegans bajo influencia endocannabinoide. El método también se puede expandir a otros modelos de estudio, por lo que es útil para diferentes objetivos. La norma, preparada como se ha informado aquí, se ha aplicado para desarrollar con éxito un método cromatográfico rápido y fiable que permita la detección y cuantificación efectivas de 2-AG de manera reproducible.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los endocannabinoides son una clase de lípidos que se han implicado en la regulación de la formación de dauer en C. elegans7. Más específicamente, la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUF) es importante para el tráfico de colesterol y el desarrollo reproductivo de gusanos. Aquí se revela que 2-AG, un ácido araquidónico que contiene endocannabinoide, es responsable de restitución de la larva dauer a su ciclo normal en gusanos que han deteriorado el metabolismo del cole…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de la Agencia Nacional de Promoción Científica Tecnológica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., y B.H.C. son becarios de CONICET. D.D.M. y G.R.L. son miembros de la Carrera de Investigación de CONICET. Estamos agradecidos a Gonzalo Lamberto (INMET) por el análisis de LC-MS/MS y la discusión útil. Ramiro Ortega y María Soledad Casasola han realizado rodajes y ediciones en coche desde la Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia y Políticas Internacionales, Universidad Nacional de Rosario en Rosario, Argentina.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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