स्वचालित छवि प्रसंस्करण का उपयोग कर विखंडन और Budding खमीर में लिपिड ड्रॉपलेट सामग्री का विश्लेषण
Summary
यहाँ, हम स्वचालित पता लगाने और विखंडन और नवोदित खमीर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों में लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विवरण के एक MATLAB कार्यान्वयन प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
लिपिड चयापचय और इसके विनियमन दोनों बुनियादी और लागू जीवन विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के लिए ब्याज की हैं. इस संबंध में, विभिन्न खमीर प्रजातियों लिपिड चयापचय अनुसंधान में या औद्योगिक लिपिड उत्पादन के लिए मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है. लिपिड बूंदों अत्यधिक गतिशील भंडारण निकायों रहे हैं और उनके सेलुलर सामग्री लिपिड चयापचय राज्य का एक सुविधाजनक readout का प्रतिनिधित्व करता है. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सेलुलर लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पसंद की एक विधि है, क्योंकि यह व्यापक रूप से उपलब्ध उपकरणों पर निर्भर करता है और व्यक्तिगत लिपिड बूंदों के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा, सूक्ष्म छवि विश्लेषण स्वचालित किया जा सकता है, बहुत समग्र विश्लेषण throughput बढ़ रही है. यहाँ, हम स्वचालित का पता लगाने और तीन अलग मॉडल खमीर प्रजातियों में व्यक्तिगत लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विवरण के लिए एक प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक कार्यप्रवाह का वर्णन: विखंडन खमीर Schizosaccharomyces pombe और शिजोसाकेरोमायस जैपोनिकस, और नवोदित खमीर सैकेरोमाइस सेरेविएस. लिपिड बूंदों BODIPY 493/503 के साथ कल्पना कर रहे हैं, और सेल-अपारगम्य फ्लोरोसेंट डेक्सट्रन सेल सीमाओं की पहचान करने में मदद करने के लिए संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाता है। कोशिकाओं को हरे और नीले चैनलों में 3 डी epifluorscence माइक्रोस्कोपी के अधीन हैं और जिसके परिणामस्वरूप z-स्टैक छवियों एक MATLAB पाइप लाइन द्वारा स्वचालित रूप से संसाधित कर रहे हैं. प्रक्रिया प्रमुख स्प्रेडशीट या सांख्यिकीय संकुल में बहाव विश्लेषण के लिए उपयुक्त एक सारणीबद्ध प्रारूप में सेलुलर लिपिड छोटी बूंद सामग्री और व्यक्तिगत लिपिड छोटी बूंद विशेषताओं पर अमीर मात्रात्मक डेटा आउटपुट. हम विभिन्न स्थितियों है कि सेलुलर लिपिड चयापचय को प्रभावित के तहत लिपिड छोटी बूंद सामग्री का उदाहरण विश्लेषण प्रदान करते हैं.
Introduction
लिपिड सेलुलर ऊर्जा और कार्बन चयापचय, झिल्ली घटकों के संश्लेषण, और bioactive पदार्थों के उत्पादन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. लिपिड चयापचय पर्यावरण की स्थिति, पोषक तत्वों की उपलब्धता और सेल-साइकिल चरण1के अनुसार ठीक-ठाक होता है। मनुष्यों में लिपिड चयापचय को मोटापे, टाइप II मधुमेह और कैंसर2जैसे रोगों से जोड़ा गया है। उद्योग में, खमीर जैसे सूक्ष्मजीवों द्वारा उत्पादित लिपिड अक्षय डीजल ईंधन3के एक आशाजनक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाएं तथाकथित लिपिड बूंदों (एलडी) में तटस्थ लिपिड संग्रहीत करती हैं। ये विकासवादी संरक्षित निकाय ट्राइसाइल्ग्लिसरोल, स्टेरिल एस्टर, एक बाहरी फॉस्फोलिपिड मोनोलेयर और संबद्ध प्रोटीन1से बने होते हैं। एल डी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में उत्पन्न होता है, सेल-चक्र या विकास-चरण गतिशीलता लागू करता है, और सेलुलर लिपिड होमियोस्टेसिस1के लिए महत्वपूर्ण हैं। LD संख्या और आकृति विज्ञान एक सुविधाजनक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब विभिन्न विकास की स्थिति के तहत लिपिड चयापचय assaying या जब म्यूटेंट के एक पैनल स्क्रीनिंग. उनके गतिशील प्रकृति को देखते हुए, व्यक्तिगत LDs के गुणों का विश्लेषण करने में सक्षम तकनीक लिपिड चयापचय के अध्ययन में विशेष रुचि के हैं.
लिपिड से संबंधित चयापचय रास्ते और उनके विनियमन का वर्णन करने के लिए विभिन्न खमीर प्रजातियों का उपयोग किया गया है, या दिलचस्प यौगिकों या ईंधन1का उत्पादन करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी में इस्तेमाल किया। इसके अलावा, मॉडल खमीर के लिए, इस तरह के नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae या दूर से संबंधित विखंडन खमीर Schizosaccharomyces pombeके रूप में, जीनोम व्यापक विलोपन तनाव पुस्तकालयों उपलब्ध है कि उच्च-थ्रूपुट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्क्रीन4,5. हाल ही में एलडी संरचना और गतिशीलता एस pombe6,7,8,9में वर्णित किया गया है , और लिपिड चयापचय से संबंधित उत्परिवर्ती उभरते मॉडल खमीर में अलग किया गया है शिजोसाकैरोमायस जैपोनिकस10|
कई तकनीकों एलडी सामग्री और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं. अधिकांश ऐसे नील लाल या BODIPY 493/503 के रूप में lipophilic रंगों के साथ एलडी के धुंधला के कुछ प्रकार के रोजगार. बाद में अधिक संकीर्ण उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से पता चलता है, और फॉस्फोलिपिड (मेम्नेल्स)11के विपरीत तटस्थ लिपिड (एलडी) के प्रति विशिष्टता में वृद्धि हुई है। फ्लोरिमिट्रिक और फ्लो-साइटोमेट्री विधियों का उपयोग विभिन्न कवक प्रजातियों में सफलतापूर्वक किया गया है ताकि जीनों और विकास की स्थितियों को उजागर किया जा सके जो भंडारण लिपिड सामग्री12,13,14,15को प्रभावित करती हैं . जबकि इन तरीकों उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, वे संख्या और कोशिकाओं में अलग-अलग LDs की आकृति विज्ञान उपाय नहीं कर सकते, जो विकास की स्थिति और जीनोटाइप के बीच नाटकीय रूप से अलग कर सकते हैं. सुसंगत रमन प्रकीर्णन या डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी लेबल-मुक्त तरीके हैं जो एलडी स्तर के डेटा को प्राप्त करते हैं, लेकिन इसके लिए विशेष महंगे उपकरण16,17,18की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी, एलडी सामग्री पर विस्तृत डेटा प्रदान कर सकता है, जबकि आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग कर सकते हैं। कई विश्लेषण वर्कफ़्लोज़ मौजूद हैं जो छवि डेटा से सेल/एलडी डिटेक्शन में परिष्कार और स्वचालन के विभिन्न डिग्री की सुविधा रखते हैं, और विभिन्न सेल प्रकारों के लिए ऑप्टिमाइज़ किए जाते हैं, जैसे बड़े LDs19,20 के साथ मेटाज़ोअन कोशिकाओं , 21, या नवोदित खमीर17,22,23. इन दृष्टिकोणों में से कुछ केवल 2 डी में काम (उदा., अधिकतम प्रक्षेपण छवियों पर), जो मज़बूती से सेलुलर एलडी सामग्री का वर्णन करने में विफल हो सकता है. हमारे ज्ञान के लिए, कोई उपकरण विखंडन खमीर सूक्ष्म डेटा से एलडी सामग्री और आकृति विज्ञान के निर्धारण के लिए मौजूद हैं. स्वचालित और मजबूत एलडी स्तर के विश्लेषण के विकास में वृद्धि हुई संवेदनशीलता और बढ़ाया सांख्यिकीय शक्ति लाना होगा, और तटस्थ लिपिड सामग्री पर अमीर जानकारी प्रदान करते हैं, आदर्श रूप से कई खमीर प्रजातियों में.
हम खमीर कोशिकाओं के 3 डी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से एलडी सामग्री विश्लेषण के लिए एक कार्यप्रवाह विकसित किया है. लाइव सेल को क्रमशः एलडी कल्पना करने और सेल सीमाओं का निर्धारण करने के लिए BODIPY 493/503 और Cascade Blue dextran के साथ दाग रहे हैं। कोशिकाओं कांच स्लाइड पर स्थिर कर रहे हैं और एक मानक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर z-स्टैक इमेजिंग के अधीन. छवियाँ तो MATLAB, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया (वाणिज्यिक) पैकेज में लागू एक स्वचालित पाइप लाइन द्वारा संसाधित कर रहे हैं. पाइप लाइन छवि पूर्व प्रसंस्करण, विभाजन (कोशिकाओं बनाम पृष्ठभूमि, मृत कोशिकाओं को हटाने), और एलडी पहचान करता है। रिच एलडी-स्तर डेटा, जैसे LD आकार और फ्लोरोसेंट तीव्रता, फिर प्रमुख स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर उपकरणों के साथ संगत एक सारणीबद्ध स्वरूप में प्रदान किए जाते हैं. कार्यप्रवाह सफलतापूर्वक एस pombe24में लिपिड चयापचय पर नाइट्रोजन स्रोत की उपलब्धता के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अब हम एस pombeमें कार्यप्रवाह की कार्यक्षमता का प्रदर्शन, एस Japonicus और एस cerevisiae,विकास की स्थिति या म्यूटेंट कि सेलुलर एलडी सामग्री को प्रभावित का उपयोग कर.
Protocol
Representative Results
Discussion
लिपिड चयापचय और इसके विनियमन की समझ दोनों बुनियादी जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है, और नैदानिक और biotechnological अनुप्रयोगों. एलडी सामग्री सेल के लिपिड चयापचय राज्य का एक सुविधाजनक रीडआउट का प्रतिनिधित्व कर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चार्ल्स विश्वविद्यालय अनुदान PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 और SVV 260310 द्वारा समर्थित किया गया था. हम माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण पाइप लाइन के विकास के साथ मदद के लिए Ond]ejez ज़ेबेस्टा धन्यवाद. हम एस cerevisiae उपभेदों के लिए ReGenEx प्रयोगशाला धन्यवाद, और JapoNet और हिरोनोरी Niki की प्रयोगशाला एस Japonicus उपभेदों के लिए. ppc1-88 तनाव खमीर आनुवंशिक संसाधन केंद्र जापान द्वारा प्रदान की गई थी. माइक्रोस्कोपी Confocal और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया सह यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष और चेक गणराज्य के राज्य बजट द्वारा वित्त पोषित (परियोजना नहीं. सी.जेड.1.05/4.1.00/16.0347 और सी.जेड.2.16/
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
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