自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析
Summary
ここでは、核分裂細胞および発芽酵母細胞の蛍光顕微鏡画像における脂質液滴の自動検出および定量的記述のMATLAB実装を提示する。
Abstract
脂質代謝とその調節は、基礎科学と応用ライフサイエンスとバイオテクノロジーの両方に関心があります。この点で、様々な酵母種は、脂質代謝研究または工業用脂質産生のモデルとして使用される。脂質液滴は非常に動的な貯蔵体であり、その細胞含有量は脂質代謝状態の便利な読み出しを表す。蛍光顕微鏡は、広く利用可能な装置に依存し、個々の脂質液滴の分析を可能にする細胞脂質液滴の定量分析のための選択方法です。さらに、顕微鏡画像解析を自動化できるため、全体的な分析スループットが大幅に向上します。ここでは、3つの異なるモデル酵母種における個々の脂質液滴の自動検出と定量的記述のための実験的および分析的ワークフローについて説明する:核分裂酵母シゾ糖菌ポンベとシゾ糖筋ジャポニクス、および発芽酵母サッカロマイセスセレビシエ.脂質液滴はBODIPY 493/503で可視化され、細胞不透過性蛍光デキストランを培養培養培養培養剤に添加し、細胞境界の特定に役立ちます。細胞は緑と青のチャネルで3D上蛍光顕微鏡に供され、得られたZスタック画像はMATLABパイプラインによって自動的に処理されます。この手順は、主要なスプレッドシートまたは統計パッケージの下流分析に適した表形式で、細胞脂質液滴含有量および個々の脂質液滴特性に関する豊富な定量データを出力します。細胞脂質代謝に影響を与える様々な条件下で脂質液滴含有量の分析例を提供する。
Introduction
脂質は、細胞エネルギーや炭素代謝、膜成分の合成、生理活性物質の産生に重要な役割を果たします。脂質代謝は、環境条件、栄養素の利用可能性および細胞周期フェーズ1に応じて微調整される。ヒトでは、脂質代謝は、肥満、II型糖尿病および癌2などの疾患に関連している。産業では、酵母などの微生物によって生成される脂質は、再生可能なディーゼル燃料3の有望な供給源を表す。細胞は、いわゆる脂質液滴(LD)に中性脂質を格納します。これらの進化的に保存された体は、トリアシルグリセロール、ステリルエステル、外側リン脂質単層および関連タンパク質1から構成される。LDsは小プラズム網膜に由来し、細胞周期または成長相力学を発揮し、細胞脂質恒常性1にとって重要である。LD番号および形態は、様々な成長条件下で脂質代謝をアッセイするとき、または変異体のパネルをスクリーニングする際に便利なプロキシとして使用することができる。そのダイナミックな性質を考えると、個々のLDの特性を分析することができる技術は、脂質代謝の研究に特に関心がある。
様々な酵母種は、脂質関連代謝経路およびその調節を記述するために使用されてきた、または興味深い化合物または燃料1を生成するためにバイオテクノロジーで使用されている。さらに、発芽酵母サッカロマイセスセレビシエや遠く関連する分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベなどのモデル酵母については、ゲノム全体の欠失歪みライブラリを高スループットに使用できる利用可能です。画面4,5.最近、Ld組成物とダイナミクスはS.pombe6,7,8,9に記載されており、脂質代謝に関連する変異体は、新興モデル酵母中に単離されている。シゾサッカロマイセスジャポニカス10.
LDの内容とダイナミクスを研究するために、数多くの技術が利用可能です。ほとんどはナイルレッドやBODIPY 493/503などの親油性染料でLDのいくつかの種類の染色を採用しています。後者は、より狭い励起および放出スペクトルを示し、リン脂質(膜)11とは対照的に中性脂質(LD)に対する特異性の増加を示す。フッ素測定およびフローサイトメトリー法は、貯蔵脂質含有量12、13、14、15に影響を与える遺伝子および成長条件を明らかにするために、様々な真菌種で成功して使用されてきた。これらの方法はハイスループットアプリケーションに適していますが、細胞内の個々のLDの数と形態を測定することはできません。コヒーレントラマン散乱またはデジタルホログラフィック顕微鏡は、LDレベルのデータを生成するラベルフリーの方法ですが、特殊な高価な機器16、17、18を必要とします。一方、蛍光顕微鏡は、一般的に利用可能な機器や画像解析ソフトウェアツールを利用しながら、LD含有量に関する詳細なデータを提供することができます。画像データからのセル/LD検出における様々な高度化と自動化を特徴とするいくつかの解析ワークフローが存在し、大きなLDを持つメタゾン細胞など、異なる細胞タイプに最適化されています 19,20,21, または発芽酵母17,22,23.これらのアプローチの一部は、2D(例えば、最大投影画像)でのみ動作し、セルラーLD含有量を確実に記述できない場合があります。我々の知るうる場合、核分裂酵母顕微鏡データからLD含有量と形態を決定するためのツールは存在しない。自動化された堅牢なLDレベルの分析の開発は、感度の向上と高められた統計力をもたらし、理想的には複数の酵母種で、中性脂質含有量に関する豊富な情報を提供します。
酵母細胞の3D蛍光顕微鏡画像からLD含有量解析のワークフローを開発しました。生細胞は、BODIPY 493/503とカスケードブルーデキトランで染色され、それぞれLDを可視化し、細胞境界を決定します。細胞はガラススライド上に固定化され、標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用してZスタックイメージングを行います。画像は、統計分析のために広く使用されている(商用)パッケージであるMATLABに実装された自動化されたパイプラインによって処理されます。パイプラインは、イメージ前処理、セグメンテーション (セルと背景、死んだセルの除去)、および LD 識別を実行します。LD サイズや蛍光強度などのリッチ LD レベルのデータは、主要なスプレッドシート ソフトウェア ツールと互換性のある表形式で提供されます。このワークフローは、S.pombe24における脂質代謝に対する窒素源の利用可能性の影響を決定するために正常に使用された。次に、細胞の LD 含有量に影響を与える成長条件または変異体を使用して、S. pombe、S. japonicusおよび S. cerevisiaeのワークフローの機能を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
脂質代謝とその調節の理解は、基礎生物学と臨床およびバイオテクノロジーの応用の両方にとって重要です。LD含有量は、細胞の脂質代謝状態の読み出しを表し、蛍光顕微鏡はLD含有量決定に用いられる主要な方法の1つである。提示されたプロトコルは、3つの異なる形態的に異なる酵母種における個々のLDの自動検出および定量的記述を可能にする。私たちの知る場合、核分裂酵母に対する?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、チャールズ大学助成金PRIMUS/MED/26、GAUK 1308217とSVV 260310によってサポートされました。私たちは、画像解析パイプラインの顕微鏡検査と開発に関するOndéej Sebestaに感謝します。私たちは、S.セレビシエ株のためのReGenExラボ、およびS.ジャポニカス株のためのJapoNetとニキヒロノリの研究室に感謝します。ppc1-88株は、酵母遺伝資源センタージャパンによって提供された。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算(プロジェクトNo.)が共同出資する共焦点・蛍光顕微鏡検査所で行われました。CZ.1.05/4.1.00/16.0347およびCZ 2.16/3.1.00/21515)。
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
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