ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית
Summary
כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.
Abstract
חילוף החומרים ליפיד והרגולציה שלה הם בעלי עניין הן בסיסיות והן מדעי החיים המוחלים וביוטכנולוגיה. בהקשר זה, מינים שמרים שונים משמשים כמודלים במחקר חילוף חומרים לשומנים או לייצור השומנים התעשייתי. טיפות השומנים הם גופי אחסון דינאמי מאוד והתוכן הסלולרי שלהם מייצג הבדיקה נוח של מצב מטבולית השומנים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא שיטה של בחירה עבור ניתוח כמותי של טיפות שומנים סלולריים, כפי שהוא מסתמך על ציוד זמין נרחב מאפשר ניתוח של טיפות שומנים בודדים. יתר על כן, ניתוח תמונה מיקרוסקופיים יכול להיות אוטומטי, הגדלת מאוד התפוקה הכוללת הניתוח. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה ניסיונית ואנליטית עבור זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בודדות בשלושה מינים שונים של שמרים מודל: ביקוע שיאת הביקוע ו . והשמרים השיכחויות טיפות ליפידים הם דמיינו עם bodipy 493/503, ו תוספי תא-הניאון מתווסף למדיית התרבות כדי לעזור לזהות גבולות התא. תאים חשופים למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית תלת-ממדית בערוצים ירוקים וכחולים והתמונות של מחסנית z מעובדות באופן אוטומטי על-ידי צינור MATLAB. ההליך פלט נתונים כמותיים עשיר על השומנים הסלולר תוכן droplet ומאפיינים בודדים droplet השומנים בפורמט טבלאי מתאים ניתוח במורד הגיליון האלקטרוני או חבילות סטטיסטיות. אנו מספקים למשל ניתוחים של שומנים בתוכן droplet בתנאים שונים המשפיעים על חילוף החומרים של השומנים הסלולריים.
Introduction
שומנים לשחק תפקידים מהותיים באנרגיה התאית פחמן מטבוליזם, סינתזה של רכיבים ממברנה, וייצור של חומרים אקטיביים. חילוף החומרים ליפיד הוא מכוונן בהתאם לתנאי הסביבה, זמינות מזינים ו-מחזור התא שלב1. בבני אדם, חילוף החומרים ליפיד כבר מחובר למחלות, כגון השמנה, סוכרת סוג II וסרטן2. בתעשייה, שומנים שיוצרו על ידי מיקרואורגניזמים, כגון מיאס, מייצגים מקור מבטיח של דלק דיזל מתחדשת3. תאים מאחסנים שומנים ניטרליים ב שנקרא טיפות שומנים בדם (מקרא). הגופים האבולוצדיים הללו מורכבים מטריליגליליפוספלים, אסטרים של שריר, שריר הפוספוליפיד החיצוני וחלבונים משויכים1. המילד מקורם ברשת האנדופלזמית, מחזור התאים או הצמיחה-שלב התפתחות, והם חשובים עבור הומאוסטזיס שומנים סלולריים1. מספר LD ומורפולוגיה ניתן להשתמש כמו פרוקסי נוח כאשר הדבר מטבוליזם השומנים תחת תנאי צמיחה שונים או בעת הקרנת פאנל של מוטציות. בהתחשב האופי הדינמי שלהם, טכניקות מסוגל לנתח את המאפיינים של האדם היחיד מתעניין מחקרים של מטבוליזם השומנים.
מינים שמרים שונים שימשו לתיאור מסלולים מטבולית הקשורים השומנים ואת הרגולציה שלהם, או בשימוש ביוטכנולוגיה לייצר תרכובות מעניינות או דלקים1. יתר על כן, עבור מודלים של מודל, כגון שמרים לבקוע cerevisiae ס או הקשורים ביקוע הקשורות שמרים שיניים, הגנום-רחב מחיקה הספריות זמינים כי ניתן להשתמש עבור תפוקה גבוהה מסכי4,5. לאחרונה LD קומפוזיציה ודינמיקה תוארו ב -S. ביקוע6,7,8,9, מוטציות הקשורות חילוף החומרים השומנים כבר מבודדים במודל המתעוררים שמרים . כן.
טכניקות רבות זמינות כדי ללמוד תוכן LD ודינמיקה. רוב להעסיק סוג כלשהו של כתמים של המכונה עם ליפופילית צבעים כגון הנילוס אדום או BODIPY 493/503. האחרון מראה עירור צר יותר ספקטרום פליטה, ו מוגברת ספציפיות לעבר שומנים ניטרליים (המכונה) לעומת פוספוליפידים (ממברנות)11. פלואורימטריה וזרימה-cytometry שיטות שימשו בהצלחה מינים פטרייתיים שונים כדי לחשוף גנים ותנאי גדילה המשפיעים על אחסון השומנים תוכן12,13,14,15. בעוד ששיטות אלה מתאימות יישומים בעלי תפוקה גבוהה, הם אינם יכולים למדוד את המספרים ואת המבנה של התעודות הזהות הבודדות בתאים, אשר יכולים להיות שונים באופן דרמטי בין תנאי גדילה לבין גנוטיפים. פיזור ראמאן קוהרנטי או מיקרוסקופ הולוגרפי דיגיטלי הן שיטות ללא תווית המפיקות נתונים ברמת LD, אך דורשות ציוד יקר מיוחד16,17,18. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, יכול לספק נתונים מפורטים על תוכן LD, תוך שימוש נפוץ מכשירים וניתוח תמונה כלי התוכנה. קיימות מספר זרימות עבודה של ניתוח התכונות דרגות שונות של תחכום ואוטומציה בזיהוי תא/LD מנתוני תמונה, והם ממוטבים עבור סוגי תאים שונים, כגון תאים מטזובן עם מזהה גדול19,20 , , עשריםושבעה. חלק מגישות אלה פועלות רק ב-2D (לדוגמה, בתמונות הקרנה מרביות), שעשויות להיכשל באופן מהימן בתיאור התוכן התאי של ה-LD. לידיעתך, לא קיימים כלים לקביעת תוכן LD ומורפולוגיה מנתונים מיקרוסקופיים שמרים ביקוע. פיתוח של ניתוח ברמת LD אוטומטי וחסון יביא רגישות מוגברת ועוצמה סטטיסטית משופרת, ולספק מידע עשיר על תוכן ניטרלי השומנים, באופן אידיאלי במינים שמרים מרובים.
פיתחנו זרימת עבודה עבור ניתוח תוכן LD מתוך 3D תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של תאים שמרים. תאים חיים מוכתמים עם BODIPY 493/503 ו דטרן כחול מדורגת כדי להמחיש התעודות ולקבוע גבולות התא, בהתאמה. תאים הם מקיבוע על שקופיות זכוכית נתון הדמיה z-מחסנית באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצלי סטנדרטי. התמונות מעובדות לאחר מכן על-ידי צינור אוטומטי מיושם ב-MATLAB, חבילה נפוצה (מסחרית) עבור ניתוחים סטטיסטיים. הצינור מבצע עיבוד מקדים של תמונה, פילוח (תאים לעומת רקע, הסרת תאים מתים) ו-LD זיהוי. נתונים עשירים ברמת LD, כגון גודל LD ועוצמת קרינה, מסופקים לאחר מכן בתבנית טבלאית התואמת לכלי תוכנה מרכזיים בגיליון אלקטרוני. זרימת העבודה שימש בהצלחה כדי לקבוע את ההשפעה של זמינות מקור חנקן על חילוף החומרים לשומנים ב -S. ביקוע24. כעת אנו מדגימים את הפונקציונליות של זרימת העבודה ב -s. ביקוע, s. הפקוניקוס ו -s. cerevisiae ס, באמצעות תנאי צמיחה או מוטציות המשפיעות על תוכן LD סלולרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבנת חילוף החומרים של השומנים והרגולציה שלה חשובה הן בביולוגיה הבסיסית והן ביישומים הקליניים והביוטכנולוגיים. תוכן LD מייצג בדיקה נוחה של מצב חילוף החומרים של השומנים של התא, עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית להיות אחת השיטות העיקריות המשמשות לקביעת תוכן LD. הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי אוטומטי ו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת צ’רלס מענקים פרימוס/MED/26, GAUK 1308217 ו-SVV 260310. אנו מודים Ondřej Šebesta לקבלת עזרה עם מיקרוסקופ ופיתוח של צינור ניתוח תמונה. אנו מודים למעבדת הReGenEx לגבי זנים של מחלת ה-s. cerevisiae ס , והפקנט והירורי ניקי, עבור זנים של היפנים . Ppc1-88 זן סופק על ידי מרכז המשאבים הגנטיים שמרים יפן. המיקרוסקופיה בוצעה במעבדה למיקרוסקופיה ומיקרוסקופית הפלואורסצנטית במימון הקרן האירופית לפיתוח האזור ותקציב המדינה של צ’כיה (פרויקט מס ‘. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 ו-CZ. 2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
Referências
- Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
- Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
- Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genética. 197 (2), 451-465 (2014).
- Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
- Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
- Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
- Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
- Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
- Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
- Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
- Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
- Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
- Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
- Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
- Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
- Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
- Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
- Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
- Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
- Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
- Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
- Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
- Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
- Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
- Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).
