Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking
Summary
Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.
Abstract
Lipide metabolisme en de regulering ervan zijn van belang voor zowel elementaire als toegepaste biowetenschappen en biotechnologie. In dit verband, verschillende gist soorten worden gebruikt als modellen in lipide metabolische onderzoek of voor industriële lipide productie. Lipide druppeltjes zijn zeer dynamische opslag lichamen en hun cellulaire inhoud vertegenwoordigt een handige uitlezen van de lipide metabolische toestand. Fluorescentiemicroscopie is een methode van keuze voor kwantitatieve analyse van cellulaire lipide druppeltjes, als het steunt op algemeen beschikbare apparatuur en maakt analyse van individuele lipide druppeltjes. Bovendien, microscopische beeldanalyse kan worden geautomatiseerd, sterk verhogen van de algehele analyse doorvoer. Hier beschrijven we een experimentele en analytische workflow voor geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele lipidedrup pels in drie verschillende model gist soorten: de splijting gisten schizosaccharomyces pombe pt Schizosaccharomyces japonicus, en de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Lipide druppeltjes worden gevisualiseerd met BODIPY 493/503, en cel-ondoorlatend fluorescerende dextran wordt toegevoegd aan de cultuur media om celgrenzen te identificeren. Cellen worden onderworpen aan 3D epifluorescentie microscopie in groene en blauwe kanalen en de resulterende z-stack beelden worden automatisch verwerkt door een MATLAB pipeline. De procedure levert uitgebreide kwantitatieve gegevens op cellulaire lipide druppel inhoud en individuele lipide druppel kenmerken in een tabelvorm formaat geschikt voor downstream analyses in grote spreadsheet of statistische pakketten. Wij bieden voorbeeld analyses van lipide druppel inhoud onder verschillende omstandigheden die invloed hebben op cellulaire lipide metabolisme.
Introduction
Lipiden spelen cruciale rollen in cellulaire energie en koolstof metabolisme, synthese van membraan componenten, en productie van bioactieve stoffen. Lipide metabolisme is fijnafgesteld volgens omgevingscondities, beschikbaarheid van nutriënten en fase1van de celcyclus. Bij de mens, lipide metabolisme is verbonden met ziekten, zoals obesitas, diabetes type II en kanker2. In de industrie vormen lipiden die door micro-organismen worden geproduceerd, zoals gisten, een veelbelovende bron van hernieuwbare dieselbrandstoffen3. Cellen slaan neutrale lipiden op in zogenaamde lipide druppeltjes (LDs). Deze evolutionair behouden lichamen zijn samengesteld uit triacylglycerolen, steryl esters, een buitenste fosfolipide monolaag en geassocieerde eiwitten1. LDs zijn afkomstig uit het endoplasmisch reticulum, oefenen celcyclus of groeifase dynamiek, en zijn belangrijk voor cellulaire lipide homeostase1. LD-nummer en morfologie kan worden gebruikt als een handige proxy wanneer het lipide metabolisme onder verschillende groeiomstandigheden of bij het screenen van een panel van mutanten. Gezien hun dynamische karakter zijn technieken die de eigenschappen van individuele LDs kunnen analyseren van bijzonder belang in onderzoeken naar lipide-metabolisme.
Verschillende gist soorten zijn gebruikt om lipide-gerelateerde metabole trajecten en hun regulering te beschrijven, of gebruikt in de biotechnologie om interessante verbindingen of brandstoffen te produceren1. Bovendien zijn voor model gisten, zoals de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae of de ver verwante Splijtings gist schizosaccharomyces pombe, genoom-Wide deletie stam bibliotheken beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor hoge doorvoer schermen4,5. Onlangs is LD samenstelling en dynamiek beschreven in S. pombe6,7,8,9, en mutanten gerelateerd aan lipide metabolisme zijn geïsoleerd in de opkomende model gist Schizosaccharomyces japonicus10.
Er zijn tal van technieken beschikbaar om LD-inhoud en-dynamiek te bestuderen. De meesten gebruiken een soort kleuring van LDs met lipofiele kleurstoffen zoals Nile Red of BODIPY 493/503. De laatste toont meer nauwe excitatie en emissiespectra, en verhoogde specificiteit naar neutrale lipiden (LDs) in tegenstelling tot fosfolipiden (membranen)11. Fluorimetrische en flow-cytometrie methoden zijn met succes gebruikt in verschillende schimmelsoorten om genen en groeiomstandigheden te achterhalen die invloed hebben op opslag lipide-inhoud12,13,14,15. Hoewel deze methoden geschikt zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer, kunnen ze de aantallen en morfologie van afzonderlijke LDs in cellen niet meten, wat dramatisch kan verschillen tussen groeiomstandigheden en genotypes. Coherente Raman verstrooiing of digitale holografische microscopie zijn label vrije methoden die LD-niveau gegevens opleveren, maar vereisen gespecialiseerde dure apparatuur16,17,18. Fluorescentiemicroscopie, aan de andere kant, kan gedetailleerde gegevens verstrekken over LD-inhoud, terwijl gebruik wordt makend van algemeen beschikbare instrumenten en software tools voorbeeld analyse. Er bestaan verschillende analyse werkstromen met verschillende gradaties van verfijning en automatisering in cel/LD-detectie van afbeeldingsgegevens, en zijn geoptimaliseerd voor verschillende celtypen, zoals metazoan-cellen met grote LDS19,20 , 21, of ontluikende gisten17,22,23. Sommige van deze benaderingen werken alleen in 2D (bijvoorbeeld bij maximale projectie beelden), die de cellulaire LD-inhoud mogelijk niet betrouwbaar beschrijven. Voor onze kennis bestaan er geen hulpmiddelen voor de bepaling van LD-gehalte en morfologie van de analyse van microscopische gegevens van splijting. De ontwikkeling van geautomatiseerde en robuuste analyses op LD-niveau zou leiden tot meer gevoeligheid en meer statistisch vermogen, en biedt rijke informatie over neutraal lipide-inhoud, idealiter in meerdere gist soorten.
We hebben een workflow ontwikkeld voor LD content analyse van 3D fluorescentiemicroscopie beelden van gistcellen. Levende cellen zijn gekleurd met BODIPY 493/503 en Cascade blauwe dextran om LDs te visualiseren en celgrenzen te bepalen, respectievelijk. Cellen worden geïmmobiliseerd op glazen glijbanen en onderworpen aan z-stack beeldvorming met behulp van een standaard epifluorescentie Microscoop. Afbeeldingen worden vervolgens verwerkt door een geautomatiseerde pijplijn geïmplementeerd in MATLAB, een veelgebruikte (commerciële) pakket voor statistische analyses. De pijplijn voert de voor verwerking van afbeeldingen, segmentatie (cellen versus achtergrond, verwijdering van dode cellen) en LD-identificatie uit. Uitgebreide gegevens op LD-niveau, zoals LD-grootte en fluorescentie-intensiteit, worden vervolgens geleverd in tabelvorm die compatibel is met belangrijke spreadsheet softwaretools. De werkstroom werd met succes gebruikt om te bepalen van de impact van de beschikbaarheid van stikstofbron op lipide metabolisme in S. pombe24. We demonstreren nu de functionaliteit van de workflow in s. pombe, s. japonicus pt s. cerevisiae, waarbij gebruik wordt gemaakt van groeicondities of mutanten die het cellulaire LD-gehalte beïnvloeden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het begrip van lipide metabolisme en de regulering ervan is belangrijk voor zowel de basis biologie, en klinische en biotechnologische toepassingen. LD-gehalte staat voor een handige uitlezen van de vetmetabolisme toestand van de cel, met fluorescentiemicroscopie als een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt voor de bepaling van LD-inhoud. Het gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele LDs in drie verschillende en morfologisch verschillende gist soort…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Karelsuniversiteit subsidies PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 en SVV 260310. We danken Ondřej Šebesta voor hulp met microscopie en ontwikkeling van de pijplijn voorbeeld analyse. We danken het ReGenEx Lab voor s. cerevisiae stammen, en Japonet en Hironori niki’s Lab voor s. japonicus stammen. De ppc1-88 stam werd geleverd door het gist genetische hulpmiddel centrum Japan. Microscopie werd uitgevoerd in het laboratorium voor confocale en fluorescentiemicroscopie, gecofinancierd door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling en de staatsbegroting van de Tsjechische Republiek (Projectnr. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 en CZ. 2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
Referências
- Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
- Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
- Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genética. 197 (2), 451-465 (2014).
- Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
- Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
- Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
- Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
- Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
- Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
- Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
- Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
- Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
- Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
- Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
- Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
- Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
- Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
- Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
- Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
- Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
- Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
- Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
- Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
- Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
- Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).
