Analyse av lipid dråpe innhold i fisjon og spirende gjær bruker automatisert image processing

Summary

Her presenterer vi en MATLAB implementering av automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av lipid dråper i fluorescens mikroskopi bilder av fisjon og spirende gjærceller.

Abstract

Lipid metabolisme og regulering er av interesse for både grunnleggende og anvendt biovitenskap og bioteknologi. I denne forbindelse er ulike gjær arter brukes som modeller i lipid metabolsk forskning eller for industriell lipid produksjon. Lipid dråper er svært dynamisk lagring organer og deres mobilnettet innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolske tilstand. Fluorescens mikroskopi er en metode for valg for kvantitativ analyse av cellulære lipid dråper, som det er avhengig av allment tilgjengelig utstyr og tillater analyse av individuelle lipid dråper. Videre kan mikroskopisk bildeanalyse være automatisert, i stor grad øke samlet analyse gjennomstrømming. Her beskriver vi en eksperimentell og analytisk arbeidsflyt for automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av individuelle lipid dråper i tre forskjellige modell gjær arter: den fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe og Schizosaccharomyces japonicus, og den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. Lipid dråper er visualisere med BODIPY 493/503, og celle-ugjennomtrengelig fluorescerende dextran er lagt til kulturen Media for å identifisere celle grenser. Celler utsettes for 3D-epifluorescence mikroskopi i grønne og blå kanaler, og de resulterende z-stack-bildene behandles automatisk av en MATLAB-pipeline. Prosedyren utganger rike kvantitative data på mobilnettet lipid dråpe innhold og individuelle lipid dråpe egenskaper i tabellformat egnet for nedstrøms analyser i store regneark eller statistiske pakker. Vi gir eksempel analyser av lipid dråpe innhold under ulike forhold som påvirker mobilnettet lipid metabolisme.

Introduction

Lipider spiller avgjørende roller i cellulær energi og karbon metabolisme, syntese av membran komponenter, og produksjon av bioaktive stoffer. Lipid metabolisme er finjustert i henhold til miljømessige forhold, næringsstoffer tilgjengelighet og celle-syklus fase¹. Hos mennesker, lipid metabolisme har vært koblet til sykdommer, som fedme, type II diabetes og kreft². I industrien, lipider produsert av mikroorganismer, slik som gjær, representerer en lovende kilde til fornybar diesel brensel³. Celler lagrer nøytrale lipider i såkalte lipid dråper (LDs). Disse evolutionarily bevarte organer er sammensatt av triacylglyceroler, steryl estere, en ytre fosfolipid monolag og tilhørende proteiner¹. LDs opprinnelse i endoplasmatiske retikulum, utøve celle-syklus eller vekst-fase dynamikk, og er viktig for mobilnettet lipid homeostase¹. LD-nummer og morfologi kan brukes som en praktisk proxy når assaying lipid metabolisme under ulike vekstforhold eller når screening et panel av mutanter. Gitt deres dynamiske natur, teknikker i stand til å analysere egenskapene til enkelte LDs er av spesiell interesse for studier av lipid metabolisme.

Ulike gjær arter har blitt brukt til å beskrive lipid-relaterte metabolske trasé og deres regulering, eller brukes i bioteknologi til å produsere interessante forbindelser eller brensel¹. Videre, for modell gjær, slik som spirende gjær Saccharomyces cerevisiae eller fjernt relaterte fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe, Genova-Wide sletting belastning bibliotekene er tilgjengelige som kan brukes for høy gjennomstrømming skjermer^4,5. Nylig ld sammensetning og dynamikk har blitt beskrevet i S. pombe^6,7,8,9, og mutanter relatert til lipid metabolisme har blitt isolert i den nye modellen gjær Schizosaccharomyces japonicus¹⁰.

Det finnes mange teknikker for å studere LD-innhold og dynamikk. De fleste ansetter en slags farging av LDs med lipofile fargestoffer som Nile Red eller BODIPY 493/503. Sistnevnte viser mer smale eksitasjon og utslipp Spectra, og økt spesifisitet mot nøytrale lipider (LDs) i motsetning til fosfolipider (membraner)¹¹. Fluorimetric og Flow-flowcytometri metoder har blitt brukt med hell i ulike fungal arter for å avdekke gener og vekstforhold som påvirker lagring lipid innhold¹²,¹³,^14,15. Selv om disse metodene er egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømming, kan de ikke måle tallene og morfologi av individuelle LDs i celler, noe som kan variere dramatisk mellom vekstforhold og genotyper. Sammenhengende Raman spredning eller digital holografisk mikroskopi er Label-frie metoder som gir ld-nivå data, men krever spesialisert dyrt utstyr^16,17,18. Fluorescens mikroskopi kan derimot gi detaljerte data om LD-innhold, samtidig som de bruker allment tilgjengelige instrumenter og verktøy for bildeanalyse. Det finnes flere analyse arbeidsflyter som har ulike grader av raffinement og automatisering i celle/ld-gjenkjenning fra bildedata, og er optimalisert for ulike celletyper, for eksempel metazoan-celler med stor LDs^{19,20 , 21}, eller spirende gjær^17,22,23. Noen av disse tilnærmingene fungerer bare i 2D (for eksempel på maks projeksjons bilder), som kan unnlate å beskrive det cellulære LD-innholdet på en pålitelig måte. Til vår kunnskap finnes det ingen verktøy for bestemmelse av LD-innhold og morfologi fra fisjon gjær mikroskopiske data. Utvikling av automatiserte og robuste LD-nivå analyser vil gi økt følsomhet og forbedret statistisk kraft, og gi rik informasjon om nøytralt lipid innhold, ideelt i flere gjær arter.

Vi har utviklet en arbeidsflyt for LD-innhold analyse fra 3D fluorescens mikroskopi bilder av gjærceller. Levende celler er farget med BODIPY 493/503 og Cascade Blue dextran å visualisere LDs og bestemme celle grenser, henholdsvis. Celler er immobilisert på glass lysbilder og utsatt for z-stack Imaging ved hjelp av et standard epifluorescence mikroskop. Bilder blir deretter behandlet av en automatisert rørledning implementert i MATLAB, en mye brukt (kommersiell) pakke for statistiske analyser. Rørledningen utfører forbehandling av bilder, segmentering (celler i forhold til bakgrunn, fjerning av døde celler) og LD-identifikasjon. Rike data på LD-nivå, for eksempel LD-størrelse og fluorescens intensitet, blir deretter gitt i tabellformat som er kompatible med viktige verktøy for regnearkprogrammer. Arbeidsflyten ble brukt med hell for å bestemme virkningen av nitrogen kilde tilgjengelighet på lipid metabolisme i S. pombe²⁴. Vi viser nå funksjonaliteten til arbeidsflyten i s. pombe, s. japonicus og s. cerevisiae, ved hjelp av vekstforhold eller mutanter som påvirker mobilt ld-innhold.

Protocol

1. utarbeidelse av løsninger og Media Forbered lipid farging løsning. For å forberede lager lipid farge løsning oppløse 10 mg BODIPY 493/503 i 10 mL vannfri DMSO (endelig konsentrasjon 1 mg/mL). Løs opp hele innholdet i et 10 mg BODIPY 493/503 hetteglass for å forhindre tap av materiale under veiing.Forsiktig: DMSO kan passere gjennom huden. Bruk egnet personlig verneutstyr. Forbered arbeider lipid farge løsning ved å blande 100 μL av 1 mg/mL…

Representative Results

Hele prosedyren er oppsummert i figur 1 for fisjon gjær (den spirende gjær arbeidsflyten er analogt), og nedenfor gir vi eksempler på hvordan arbeidsflyten kan brukes til å studere ld innhold i tre forskjellige gjær arter under ulike forhold kjent for å påvirke mobilt LD-innhold. Hvert eksempel representerer et enkelt biologisk eksperiment. <b…

Discussion

Forståelsen av lipid metabolisme og dens regulering er viktig for både grunnleggende biologi, og kliniske og bioteknologisk applikasjoner. LD innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolisme tilstand av cellen, med fluorescens mikroskopi være en av de viktigste metodene som brukes for LD innhold besluttsomhet. Den presenterte protokollen tillater automatisert oppdagelse og kvantitativ beskrivelse av individuelle LDs i tre forskjellige og morfologisk distinkte gjær arter. Til vår kunnskap, finnes det …

Materials

12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG	Hamamatsu		or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99%	Merck	A9126-25G
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)	Thermo Fisher Scientific	D3922	for neutral lipid staining
D-(+) – Glucose, ≥99.5%	Merck	G7021
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Thermo Fisher Scientific	D1976	for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5%	Merck	D4540	or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose	Formedium	PMD0405	medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software	NIH		or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5	VWR	630-2186	use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0	Mathworks
Lectin from Glycine max (soybean)	Merck	L1395	for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2	Mathworks
Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness	Knittel Glass	L762601.2	use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement	Olympus		or equivalent
pentaband filter set	Semrock	F66-985	brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4	Mathworks
SP supplements	Formedium	PSU0101
standard office computer capable of running MATLAB
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1	Mathworks
Universal peptone M66 for microbiology	Merck	1070431000
UPLSAPO 60XO objective	Olympus		or equivalent
Yeast extract	Formedium	YEA03
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0405