Een Muriene cellijn gebaseerd model van chronische CDK9 remming om wijdverbreide niet-genetische transcriptionele rek defecten te bestuderen (TEzeker) in kankers
Summary
Het protocol Details een in vitro muriene carcinoom model van niet-genetische defecte transcriptie rek. Hier wordt chronische remming van CDK9 gebruikt voor het onderdrukken van productieve verlenging van RNA Pol II langs pro-inflammatoire respons genen om na te bootsen en bestuderen van de klinisch overgediend TEzeker fenomeen, aanwezig in ongeveer 20% van alle soorten kanker.
Abstract
We hebben eerder gemeld dat een subset van kankers wordt gedefinieerd door wereldwijde transcriptionele deregulaties met wijdverbreide tekortkomingen in mRNA transcriptie verlenging (TE) — we noemen dergelijke kankerszeker. Met name, TEzeker kankers worden gekenmerkt door valse transcriptie en defecte mRNA verwerking in een grote reeks van genen, zoals INTERFERON/Jak/stat en TNF/NF-κb trajecten, wat leidt tot hun onderdrukking. Het TEabsoluut subtype van tumoren in niercelcarcinoom en gemetastaseerde melanoom patiënten correleren significant met slechte respons en uitkomst in immunotherapie. Gezien het belang van het onderzoeken vanzeker kankers — omdat het een belangrijke belemmering tegen immunotherapie poreert — is het doel van dit protocol om een in vitro tebepalen muismodel voor het bestuderen van deze wijdverspreide, niet-genetische transcriptionele afwijkingen in kankers en nieuwe inzichten verwerven, nieuw gebruik voor bestaande geneesmiddelen, of nieuwe strategieën tegen dergelijke kankers vinden. We detail het gebruik van chronische flavopiridol gemedieerde CDK9 remming aan abrote fosforylering van serine 2 residu op de C-terminale herhalings domein (CTD) van RNA polymerase II (RNA Pol II), onderdrukken van de vrijlating van RNA Pol II in productieve transcriptie Rek. Gezien het feit dat TEzeker kankers zijn niet geclassificeerd onder een specifieke somatische mutatie, een farmacologisch model is voordelig, en het beste bootst de wijdverbreide transcriptionele en epigenetische gebreken waargenomen in hen. Het gebruik van een geoptimaliseerde subletale dosis flavopiridol is de enige effectieve strategie bij het creëren van een generaliseerbaar model van niet-genetische wijdverbreide verstoring in transcriptie verlenging en mRNA-verwerkingsfouten, waarbij de klinisch waargenomen TE zeker kenmerken. Daarom, dit model van TEzeker kan worden ingezet om te dissect, cel-autonome factoren waardoor ze in verzet tegen immuun-gemedieerde celaanval.
Introduction
Een belangrijke snelheids beperkende stap in de uitdrukking van bijna alle actieve genen is de overgang van RNA-polymerase II (RNA Pol II) van Promoter-proximale onderbreken naar productieve rek1,2. Gezien het feit dat epigenetische disregulatie van transcriptionele rek helpt bij de progressie van meervoudige menselijke maligniteiten gedefinieerd als TEzeker, wat leidt tot suboptimale signalering in de pro-inflammatoire respons trajecten ten bedrage van een slechte respons en uitkomst van immunotherapie3, is het overkoepelende doel van dit protocol om een nuttig in vitro model op te zetten om deze wijdverbreide niet-genetische transcriptionele afwijkingen in kankers te bestuderen. In dit licht, het gebruik van chronische farmacologische remming van CDK9 is een effectieve strategie voor het creëren van een generaliseerbaar model van niet-genetische wijdverbreide verstoring in transcriptie rek en mRNA verwerking gebreken. De logica achter het gebruik van chronische CDK9 remming is dat het de fosforylering van serine 2-residu in de C-terminale herhalings domein (CTD) van RNA Pol II abrogates, waardoor het vrijkomen van RNA Pol II wordt onderdrukt tot een productieve transcriptie verlenging. Ook, TEzeker kanker, eerder beschreven door onze groep3, zijn niet geclassificeerd onder een specifieke somatische mutatie. Daarom is een niet-genetisch (farmacologisch) model voordelig en wordt het best de wijdverbreide transcriptionele en epigenetische defecten die in hen zijn waargenomen, nagebootst. De methode hierin Details de generatie en de karakterisering van chronische flavopiridol behandelings model van Murine kankercellen. Deze methode verstoort aantoonbaar transcriptie verlenging langs genen die gekenmerkt worden door langere genomische lengtes, met geposeerde promotors en induceerbaar uitdrukkingen zoals TNF/NF-κB en interferon/STAT signalering, grondig gecontroleerd op het niveau van transcriptie verlenging3,4,5. Over het algemeen is dit geoptimaliseerde muriene cellijn model van transcriptionele rek defecten-het enige model voor onze kennis om de nieuw beschreven TEzeker tumoren te bestuderen-drijft de weerstand tegen anti-tumor immuun aanval, waardoor een nuttig systeem om te exploiteren en onderzoeken van de kwetsbaarheden van niet-genetische defecten in kern transcriptie machines in kankers ten opzichte van immuun-gemedieerde celaanval.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA Pol II rek controle is ontstaan als een beslissende hefboom voor het reguleren van stimulus-responsieve genexpressie ten gunste van kwaadaardige cellen5,7,8. Het overwinnen van Promoter-proximale pauze tot rek en daaropvolgende mRNA-productie vereist de kinase activiteit van P-tefb9,10,11. Ons model maakt gebruik van flavopiridol (2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels ondersteund door NCI (CA193549) en CCHMC Research Innovation pilot Awards aan Kakajan Komurov en Department of Defense (BC150484) Award aan Navneet Singh. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Cancer Institute of het ministerie van defensie. De financiers hadden geen rol in het studie ontwerp, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
Referências
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
