קו תא מורנין מבוסס מודל של עיכוב כרונית CDK9 למחקר נרחב שאינם גנטיים התארכות מומים ליקויים (TEבהחלט) סרטן
Summary
הפרוטוקול מפרט קרצינומה מורמתי מחוץ לתמונה של שעתוק לא גנטי פגום. כאן, עיכוב כרוני של CDK9 משמש כדי לדכא התארכות פרודוקטיבי של RNA פול II לאורך גנים התגובה הפרו-דלקתיות לחקות ולחקור את התופעה הקלינית הרפואית TEבהחלט , נוכח כ 20% מסוגי הסרטן.
Abstract
בעבר דיווחו כי קבוצת משנה של סרטן מוגדר על ידי האוספים הגלובליים החוצה עם הליקויים הנרחבים ב-mRNA התארכות שעתוק (TE) — אנו קוראים כאלה סרטן כמו TEבהחלט. בעיקר, הסרטןבהחלט TE מאופיין על ידי תמלול מלאכותי עיבוד mrna בקבוצה גדולה של גנים, כגון אינטרפרון/JAK/STAT ו-TNF/NF-κB מסלולים, המוביל הדיכוי שלהם. TEבהחלט תת סוג של גידולים בתאי הכליה קרצינומה וחולי מלנומה גרורתית לתאם באופן משמעותי עם תגובה גרועה ותוצאה בטיפול חיסוני. בהתחשב בחשיבות של חקירת הסרטן teבהחלט -כפי שהוא רומז על מחסום משמעותי נגד טיפול חיסוני — המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל מבחנהבהחלט העכבר בטוח לחקור אלה נפוצים, לא גנטית מומים הטרנססקריפט בסרטן ולהשיג תובנות חדשות, הרומן משתמש עבור תרופות קיימות, או למצוא אסטרטגיות חדשות נגד סוגי סרטן כאלה. אנו לפרט את השימוש של פלאדידול כרונית מתווך CDK9 עיכוב לבטל זרחון של סרין 2 שאריות על התחום החוזר C-מסוף (CTD) של RNA פולימראז II (RNA פול II), דיכוי שחרורו של RNA פול II לתוך תמלול פרודוקטיבי תארכות. בהתחשב בעובדה כי הסרטןבהחלט אינם מסווגים תחת כל מוטציה סומטית ספציפית, מודל תרופתי הוא יתרון, והטוב ביותר מחקה את הטרנססקריפט הנפוץ ופגמים אפיגנטיים שנצפו בהם. השימוש במינון ממוטב תת קטלני של פלאופאפידולדול הוא האסטרטגיה היחידה יעילה ביצירת מודל הניתן להכליל של שיבוש נרחב שאינם גנטיים התארכות שעתוק ו-mRNA עיבוד פגמים, לחקות היטב את ה-TE הנצפה קלינית . בהחלט מאפיינים לכן, מודל זה של TEבהחלט יכול להיות ממונפת כדי לנתח, התאים האוטונומית מאפשר להם להתנגד התקפה תא החיסון בתיווך.
Introduction
צעד הגבלת קצב מפתח בביטוי של כמעט כל הגנים הפעילים הוא המעבר של RNA פולימראז ii (RNA Pol ii) מן היזם-הקרובים הקרובים התארכות פרודוקטיבי1,2. בהינתן כי בחוסר התקנה גנטית של התארכות ההסטריה מסייע ההתקדמות של ממאירות אנושית מרובות המוגדרים TEבהחלט, המוביל איתות תת אופטימלי במסלולי התגובה pro-דלקתיות בהיקף תגובה עלובה ואת התוצאה לטיפול חיסוני3, המטרה הרחבה של פרוטוקול זה היא להקים מודל שימושי מבחנה כדי לחקור אלה הפרעות הטרנססקריפט הנרחב שאינם גנטיים בסרטן. באור זה, השימוש של עיכוב תרופתי כרונית של CDK9 היא אסטרטגיה יעילה ליצירת מודל הניתנת להכליל של שיבוש נרחב שאינם גנטיים התארכות שעתוק ו-mRNA עיבוד פגמים. הרציונל מאחורי השימוש בעיכוב CDK9 כרונית היא כי הוא השעריה זירחון של סרין 2 שאריות על התחום החוזר C-terminal (CTD) של RNA פול II, ובכך לדכא את שחרורו של RNA פול II לתוך שעתוק פרודוקטיבי. גם, TEבהחלט סרטן, תיאר בעבר על ידי הקבוצה שלנו3, אינם מסווגים תחת כל מוטציה סומטית ספציפית. לכן, מודל לא גנטי (תרופתי) הוא יתרון, הטוב ביותר מחקה את הטרנססקריפט הנפוץ ופגמים אפיגנטיים שנצפו בהם. השיטה כאן מפרט את הדור והאפיון של מודל הטיפול פלאפירידול כרונית של תאים סרטניים מורלין. שיטה זו הדגמה משבש את התארכות התעתיק לאורך הגנים המאופיינת באורכים גנומית ארוכים יותר, עם היזמים וביטויים inducible כגון tnf/NF-κB ו-אינטרפרון/STAT איתות, נשלט באופן עמוק ברמת ה . תעתיק התארכות3,4,5 בסך הכל, זה מודל קו ממוטב של תא מורטין של ליקויים התארכות כתבי-המודל היחיד לידע שלנו כדי ללמוד את המחקר החדש שתוארובהחלט גידולים – כוננים עמידות נגד הגידול החיסון נגד הסרטן, עיבוד מערכת שימושית לנצל ו לבחון את הפגיעויות של פגמים שאינם גנטיים מכונות תמלול הליבה בסרטן לעומת-à-לעומת החיסון מתווך התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA פול II בקרת התארכות התפתחה כמנוף מכריע עבור ויסות הביטוי הגנטי תגובה תמריץ לטובת תאים ממאירים5,7,8. התגברות על משהה הקדם-הפני משתהה התארכות והייצור mrna הבאים דורש את הפעילות קינאז של P-tefb9,10,11</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה בחלק נתמך על ידי NCI (CA193549) ו CCHMC חדשנות מחקר פיילוט פרסי Kakajan Komurov, ואת המחלקה להגנה (BC150484) הפרס על Navneet סינג. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או של משרד הביטחון. לתורמים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
Referências
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
