Summary

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Published: September 16, 2019
doi:

Summary

Karmaşık insan hastalıkları geleneksel laboratuvar modeli sistemlerinde modellemek zor olabilir. Burada, insan iskelet kası biyopsilerinin immünyonfik farelere nakli yoluyla insan kas hastalığını modellemek için cerrahi bir yaklaşım tanımlıyoruz.

Abstract

Hayvan çalışmalarında gözlenen tedavi etkileri genellikle klinik çalışmalarda recapitulated başarısız. Bu sorun çok yönlü olmakla birlikte, bu başarısızlığın nedenlerinden biri yetersiz laboratuvar modellerinin kullanılmasıdır. Bu geleneksel laboratuvar organizmalarında karmaşık insan hastalıkları modeli zor, ama bu konu insan ksenogreftçalışmaları ile atlatılabilir. Burada tanımladığımız cerrahi yöntem, kas hastalığını modellemek ve klinik öncesi terapötik testler yapmak için kullanılabilen insan iskelet kası ksenogreftlerinin oluşturulmasına olanak sağlamaktadır. Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokol uyarınca, iskelet kası örnekleri hastalardan alınarak NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) host farelere nakledilir. Bu fareler olgun lenfositler yapmak için yetersizlik nedeniyle transplantasyon çalışmaları için ideal konakve bu nedenle hücre aracılı ve humoral adaptif bağışıklık yanıtları geliştirmek mümkün değildir. Konak fareler izofluran ile uyuşturulur ve fare tibialis anterior ve ekstansör digitorum longus kasları kaldırılır. İnsan kasının bir parçası daha sonra boş tibial bölmeye yerleştirilir ve peroneus longus kasının proksimal ve distal tendonlar için dikişli. Ksenogreftli kas spontan vaskülarize ve fare konak tarafından innerve, preklinik çalışmalar için bir model olarak hizmet verebilir sağlam rejenere insan kası ile sonuçlanan.

Introduction

Klinik çalışmalardan geçirilen tüm ilaç geliştirme programlarının sadece %13.8’inin başarılı olduğu ve onaylı tedavilere yol açıldığı bildirilmiştir1. Bu başarı oranı daha öncebildirilen%10.4 daha yüksek iken 2 , iyileştirme için hala önemli bir oda var. Klinik çalışmaların başarı oranını artırmak için bir yaklaşım preklinik araştırmalarda kullanılan laboratuvar modellerini geliştirmektir. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tedavi etkinliğini göstermek ve Faz 1 klinik çalışmalar dan önce toksisite değerlendirmek için hayvan çalışmaları gerektirir. Ancak, genellikle hayvan çalışmaları ve klinik çalışmalar arasında tedavi sonuçlarında sınırlı uyum vardır3. Buna ek olarak, preklinik hayvan çalışmaları için ihtiyaç kabul edilen bir hayvan modeli eksikliği hastalıklarda terapötik gelişim için aşılmaz bir engel olabilir, genellikle nadir veya sporadik hastalıklar için durumdur.

İnsan hastalığını modellemenin bir yolu, insan dokusunu immünoffik farelere naklederek ksenogreft ler üretmektir. Ksenogreft modellerinin üç temel avantajı vardır: Birincisi, diğer hayvan modellerinde asla tekrarlanabilir olmayan insan hastalığında var olan karmaşık genetik ve epigenetik anormallikleri yeniden özetleyebilirler. İkinci olarak, hasta örnekleri mevcutsa nadir veya sporadik hastalıkların modelini yapmak için ksenogreftler kullanılabilir. Üçüncü olarak, ksenogreftler tam bir in vivo sistem içinde hastalığı modeller. Bu nedenlerden dolayı, ksenogreft modellerinde tedavi etkinliği sonuçlarının hastalardaki deneylere daha fazla çevrilme olasılığının daha yüksek olduğunu varsabiliyoruz. İnsan tümör ksenogreftler zaten başarıyla multipl miyelom da dahil olmak üzere ortak kanserler için tedavi geliştirmek için kullanılmıştır, yanı sıra bireysel hastalar için kişiselleştirilmiş tedaviler4,5,6, 7 .

Son zamanlarda, ksenogreftler insan kas hastalığı bir model geliştirmek için kullanılmıştır8. Bu modelde insan kas biyopsisi örnekleri immünopsiyoksun NRG farelerin arka eklerine naklederek ksenogreftler oluşturur. Nakledilen insan miyofiberleri ölür, ancak ksenogreftte bulunan insan kas kök hücreleri daha sonra genişleyen ve engreftlenmiş insan bazal laminasını yeniden dolduran yeni insan miyofiberlerine ayrılır. Bu nedenle, bu ksenogreftlerde rejenere miyolifler tamamen insandır ve fare konakları tarafından kendiliğinden revaskülarve innerve edilir. Önemli olarak, fascioscapulohumeral kas distrofisi (FSHD) hasta kas dokusu fareler içine nakledilen insan hastalığının temel özellikleri özetler, yani DUX4 transkripsiyon faktörüifade 8. FSHD dux4 aşırı ekspresyonu neden olur, hangi epigenetik normal kasdokusundasusturuldu 9,10. FSHD ksenogreft modelinde, DUX4 spesifik morfolino ile tedavi başarıyla DUX4 ifade ve fonksiyonu bastırmak için gösterilmiştir, ve FSHD hastalar için potansiyel bir tedavi seçeneği olabilir11. Bu sonuçlar insan kas ksenogreftlerinin insan kas hastalığını modellemek ve farelerde potansiyel tedavileri test etmek için yeni bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Burada, immünyonfik farelerde insan iskelet kası ksenogreftleri oluşturmak için cerrahi yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Protocol

Katılımcıların haklarını ve refahını korumak için insan deneklerden elde edilen tüm araştırma örneklerinin kullanımı Johns Hopkins Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan deneyleri Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca onaylanmıştır. Erkek NOD-Rag1nullIL2rγnull</e…

Representative Results

Yuanfan Zhang ve ark tarafından gösterildiği gibi, bu cerrahi protokol insan iskelet kası ksenogreftler üretmek için basit bir yöntemdir8. Rejenere ksenogreftler kendiliğinden innerve hale gelir ve fonksiyonel kontraktilite gösterir. Ayrıca FSHD hastalarından ksenogreftlenen kas, FSHD hastalarında gözlenen gen ekspresyonundaki değişiklikleri özetler8. Deneyimlerimize göre, kontrol hasta örneklerinden yapılan 8 ksenogreftten yak…

Discussion

Hasta kaynaklı ksenogreftler kas hastalığını modellemek ve klinik öncesi çalışmalar yapmak için yenilikçi bir yoldur. Burada iskelet kası ksenogreftleri oluşturmak için açıklanan yöntem hızlı, basit ve tekrarlanabilir. Tek taraflı ameliyatlar 15-25 dakika, bilateral ameliyatlar 30-40 dakikada yapılabilir. Bilateral ksenogreftler ek deneysel esneklik sağlayabilir. Örneğin, araştırmacılar bir ksenogreft lokalize tedavi gerçekleştirebilirsiniz, diğer bir kontrol olarak sol. NRG fareler, patojen…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Myositis Derneği ve Peter Buck Vakfı tarafından desteklendi. Dr. Yuanfan Zhang’a ksenogreft cerrahi tekniğindeki uzmanlığını ve eğitimini paylaştığı için teşekkür ederiz.

Materials

100 mm x 15 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875712
2-Methylbutane Fisher O3551-4
20 x 30 mm micro cover glass VWR 48393-151
Animal Weighing Scale Kent Scientific SCL- 1015
Antibiotic-Antimycotic Solution Corning, Cellgro 30-004-CI
AutoClip System F.S.T 12020-00
Castroviejo Needle Holder F.S.T 12565-14
Chick embryo extract Accurate CE650TL
CM1860 UV cryostat Leica Biosystems CM1860UV
Coplin staining jar Thermo Scientific 19-4
Dissection Pins Fisher Scientific S13976
Dry Ice – pellet Fisher Scientific NC9584462
Embryonic Myosin antibody DSHB F1.652 recommended concentration 1:10
Ethanol Fisher Scientific 459836
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30071.01
Fiber-Lite MI-150 Dolan-Jenner Mi-150
Forceps F.S.T 11295-20
Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21121 recommended concentration 1:500
Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 Invitrogen A-21145 recommended concentration 1:500
Gum tragacanth Sigma G1128
Hams F-10 Medium Corning 10-070-CV
Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive Tissue seal TS1050044FP
Human specific lamin A/C antibody Abcam ab40567 recommended concentration 1:50-1:100
Human specific spectrin antibody Leica Biosystems NCLSPEC1 recommended concentration 1:20-1:100
Induction Chamber VetEquip 941444
Iris Forceps F.S.T 11066-07
Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) Envigo TD.06596 Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections
Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Kimwipes Kimberly-Clark 34155 surgical wipes
Mapleson E Breathing Circuit VetEquip 921412
Methanol Fisher Scientific A412
Mobile Anesthesia Machine VetEquip 901805
Mouse on Mouse Basic Kit Vector Laboratories BMK-2202 mouse IgG blocking reagent
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NAIR Hair remover lotion/oil Fisher Scientific NC0132811
NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice The Jackson Laboratory 007799 2 to 3 months old
O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571
Oxygen Airgas OX USPEA
PBS (phosphate buffered saline) buffer Fisher Scientific 4870500
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
ProLong™ Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)
Puralube Ophthalmic Ointment Dechra 17033-211-38
Rimadyl (carprofen) injectable Patterson Veterinary 10000319 surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg
Scalpel Blades – #11 F.S.T 10011-00
Scalpel Handle – #3 F.S.T 10003-12
Stereo Microscope Accu-scope 3075
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle Covidien VP-706-X
1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) BD Biosciences 329412
Trimmer Kent Scientific CL9990-KIT
Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge F.S.T 15009-08
VaporGaurd Activated Charcoal Filter VetEquip 931401
Wound clips, 9 mm F.S.T 12022-09

Referências

  1. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
  2. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
  3. Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
  4. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
  5. Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
  6. Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
  7. Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
  8. Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
  9. Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
  10. Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
  11. Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
  12. Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
  13. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).

Play Video

Citar este artigo
Britson, K. A., Black, A. D., Wagner, K. R., Lloyd, T. E. Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (151), e59966, doi:10.3791/59966 (2019).

View Video