免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片の実行
Summary
複雑な人間の疾患は、従来の実験室モデルシステムでモデル化するのが難しい場合があります。ここでは、ヒト骨格筋生検を免疫不不十分マウスに移植することにより、ヒト筋疾患をモデル化する外科的アプローチについて述べた。
Abstract
動物実験で観察される治療効果は、多くの場合、臨床試験で要約に失敗します。この問題は多面的ですが、この失敗の理由の1つは、不十分なラボモデルの使用です。従来の実験室生物における複雑なヒト疾患のモデル化は困難であるが、この問題はヒト異種移植片の研究を通じて回避することができる。ここで説明する外科的方法は、筋肉疾患をモデル化し、前臨床試験を行うために使用することができるヒト骨格筋異種移植片の作成を可能にする。機関レビュー委員会(IRB)承認プロトコルの下で、骨格筋標本は患者から取得され、その後NOD-Rag1 nullIL2rγヌル(NRG)宿主マウスに移植される。これらのマウスは、成熟したリンパ球を作ることができないため、移植研究のための理想的な宿主であり、したがって、細胞媒介性および体液性適応免疫応答を開発することができない。宿主マウスはイソルランで麻酔され、マウス脛骨前部および伸張デジコラム長い筋肉が除去される。人間の筋肉の一部は、空の脛骨コンパートメントに配置され、ペロンヌス長い筋肉の近位および遠位腱に縫合される。異種移植された筋肉は、マウス宿主によって自発的に血管化され、活性化され、前臨床研究のモデルとして機能し得るヒト筋肉を強く再生する。
Introduction
臨床試験を受けているすべての薬剤開発プログラムのわずか13.8%が成功し、承認された治療法1につながることが報告されています。この成功率は、以前に報告された10.4%よりも高いですが、まだ改善の余地があります。臨床試験の成功率を高めるための1つのアプローチは、前臨床研究で使用される実験室モデルを改善することです。食品医薬品局(FDA)は、第1相臨床試験の前に治療効果を示し、毒性を評価するために動物研究を必要とします。しかし、動物実験と臨床試験3の間の治療結果には、しばしば限られた一致がある。さらに、前臨床動物研究の必要性は、受け入れられた動物モデルを欠いている疾患の治療開発のための克服不可能な障壁であり、これはしばしば稀または散発性疾患の場合である。
ヒト疾患をモデル化する1つの方法は、ヒト組織を免疫不全マウスに移植して異種移植片を生成することである。異種移植片モデルには3つの主要な利点があります:まず、他の動物モデルでは再現できない可能性のあるヒト疾患に存在する複雑な遺伝的およびエピジェネティックな異常を要約することができます。第二に、異種移植片は、患者のサンプルが利用可能な場合、希少または散発性疾患をモデル化するために使用することができる。第三に、異種移植片は、生体内の完全な内で疾患をモデル化する。これらの理由から、異種移植片モデルにおける治療効果の結果は、患者の試験に翻訳する可能性が高いと仮定する。ヒト腫瘍異種移植片は、多発性骨髄腫を含む一般的な癌の治療法の開発に既に成功しており、個々の患者に対する個別化療法4、5、6、 7.
最近、異種移植片は、ヒト筋疾患8のモデルを開発するために使用されている。このモデルでは、ヒト筋肉生検標本を免疫不全NRGマウスの後肢に移植し、異種移植片を形成する。移植されたヒト筋線維は死ぬが、異種移植片に存在するヒト筋肉幹細胞は、その後、生着したヒト基底ラミナを再び生人口する新しいヒト筋線維に拡大して分化する。したがって、これらの異種移植片中の再生されたミオ繊維は完全にヒトであり、マウス宿主によって自発的に可逆化され、インビナー化される。重要なことに、マウスに移植された筋組織筋ジストロフィー(FSHD)患者の筋肉組織は、ヒト疾患の主要な特徴、すなわちDUX4転写因子8の発現を要約する。FSHDは、正常な筋肉組織9、10でエピジェネティックに沈黙しているDUX4の過剰発現によって引き起こされる。FSHD異種移植片モデルでは、DUX4特異的モルフォリノによる治療は、DUX4発現および機能を正常に抑圧することが示されており、FSHD患者11に対する潜在的な治療選択肢となりうる。これらの結果は、ヒト筋異種移植片がヒト筋肉疾患をモデル化し、マウスの潜在的な治療法をテストする新しいアプローチであることを示している。ここでは、免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片を作成する外科的方法を詳細に説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
患者由来の異種移植片は、筋肉疾患をモデル化し、前臨床試験を行う革新的な方法です。骨格筋異種移植片を作成するためにここで説明する方法は、迅速、簡単、および再現性があります。一方的な手術は15~25分、または30~40分で両側手術が可能です。両側異種移植片は、追加の実験的柔軟性を提供することができます。例えば、研究者は、一方の異種移植片の局所的な治療を行うことができ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、筋炎協会とピーターバック財団によって支援されました。異種移植片の外科技術に関する専門知識と訓練を共有してくれたユアンファン・チャン博士に感謝します。
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Referências
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- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
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