Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen
Summary
Komplexe menschliche Krankheiten können in traditionellen Labormodellsystemen eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir einen chirurgischen Ansatz zur Modellierung menschlicher Muskelerkrankungen durch die Transplantation menschlicher Skelettmuskelbiopsien in immundefizienten Mäusen.
Abstract
Behandlungseffekte, die in Tierstudien beobachtet werden, lassen sich in klinischen Studien oft nicht rekapitulieren. Obwohl dieses Problem vielschichtigen Probleme hat, ist ein Grund für diesen Ausfall die Verwendung unzureichender Labormodelle. Es ist eine Herausforderung, komplexe menschliche Krankheiten in traditionellen Labororganismen zu modellieren, aber dieses Problem kann durch das Studium menschlicher Xenografts umgangen werden. Die chirurgische Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht die Schaffung von menschlichen Skelettmuskel-Xenografts, die verwendet werden können, um Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische therapeutische Tests durchzuführen. Im Rahmen eines von einem Institutional Review Board (IRB) zugelassenen Protokolls werden Skelettmuskelproben von Patienten erworben und dann in NOD-Rag1nullIL2r-null (NRG) Wirtsmäuse transplantiert. Diese Mäuse sind ideale Wirte für Transplantationsstudien aufgrund ihrer Unfähigkeit, reife Lymphozyten herzustellen und sind daher nicht in der Lage, zellvermittelte und humoral adaptive Immunantworten zu entwickeln. Wirtsmäuse werden mit Isofluran betäuht, und die Maus tibialis anterior und extensor digitorum longus Muskeln werden entfernt. Ein Stück menschlicher Muskeln wird dann in das leere Tibialfach gelegt und an die proximalen und distalen Sehnen des Peroneus longus Muskels vernässt. Der xenotransplantierte Muskel wird vom Mauswirt spontan vaskularisiert und innerviert, was zu robust regenerierten menschlichen Muskeln führt, die als Modell für präklinische Studien dienen können.
Introduction
Es wurde berichtet, dass nur 13,8% aller Arzneimittelentwicklungsprogramme, die sich in klinischen Studien befinden, erfolgreich sind und zu zugelassenen Therapien führen1. Während diese Erfolgsquote höher ist als die zuvor gemeldeten 10,4%2, gibt es noch erheblichen Raum für Verbesserungen. Ein Ansatz zur Steigerung der Erfolgsrate klinischer Studien besteht darin, Labormodelle zu verbessern, die in der präklinischen Forschung verwendet werden. Die Food and Drug Administration (FDA) verlangt, dass Tierstudien die Wirksamkeit der Behandlung nachweisen und die Toxizität vor klinischen Phase-1-Studien bewerten. Allerdings gibt es oft eine begrenzte Übereinstimmung in den Behandlungsergebnissen zwischen Tierstudien und klinischen Studien3. Darüber hinaus kann die Notwendigkeit präklinischer Tierstudien ein unüberwindbares Hindernis für die therapeutische Entwicklung bei Krankheiten sein, bei denen kein akzeptiertes Tiermodell gilt, was häufig bei seltenen oder sporadischen Krankheiten der Fall ist.
Eine Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren, besteht darin, menschliches Gewebe in immundefizizizizizizizizizizide Mäuse zu transplantieren, um Xenografts zu erzeugen. Xenograft-Modelle haben drei wesentliche Vorteile: Erstens können sie die komplexen genetischen und epigenetischen Anomalien rekapitulieren, die bei menschlichen Krankheiten existieren und in anderen Tiermodellen möglicherweise nie reproduzierbar sind. Zweitens können Xenografts verwendet werden, um seltene oder sporadische Krankheiten zu modellieren, wenn Patientenproben verfügbar sind. Drittens modellieren Xenografts die Krankheit innerhalb eines vollständigen In-vivo-Systems. Aus diesen Gründen gehen wir davon aus, dass die Wirksamkeit der Behandlung zu Xenograft-Modellen führt, die eher zu Studien bei Patienten führen. Humantumor Xenografts wurden bereits erfolgreich verwendet, um Behandlungen für häufige Krebsarten zu entwickeln, einschließlich multiples Myelom, sowie personalisierte Therapien für einzelne Patienten4,5,6, 7.
In letzter Zeit wurden Xenografts verwendet, um ein Modell der menschlichen Muskelerkrankung zu entwickeln8. In diesem Modell werden menschliche Muskelbiopsieproben in die Hinterbeine immundefizien NRG-Mäuse transplantiert, um Xenografts zu bilden. Die transplantierten menschlichen Myofiber sterben, aber menschliche Muskelstammzellen, die im Xenograft vorhanden sind, dehnen sich anschließend aus und differenzieren sich in neue menschliche Myofiber, die die transplantierte menschliche Basallamina wieder bevölkern. Daher sind die regenerierten Myofiber in diesen Xenografts vollständig menschlich und werden spontan revaskularisiert und vom Mauswirt innerviert. Wichtig ist, fascioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD) Patienten Muskelgewebe in Mäuse transplantiert rekapituliert Schlüsselmerkmale der menschlichen Krankheit, nämlich Expression der DUX4 Transkriptionsfaktor8. FSHD wird durch Überexpression von DUX4 verursacht, das im normalen Muskelgewebe epigenetisch zum Schweigen gebracht wird9,10. Im FSHD Xenograft Modell hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit einem DUX4-spezifischen Morpholino die DUX4-Expression und -Funktion erfolgreich reprimieren und eine mögliche therapeutische Option für FSHD-Patienten sein kann11. Diese Ergebnisse zeigen, dass menschliche Muskelxenografts ein neuer Ansatz sind, um menschliche Muskelerkrankungen zu modellieren und potenzielle Therapien bei Mäusen zu testen. Hier beschreiben wir detailliert die chirurgische Methode zur Schaffung menschlicher Skelettmuskel-Xenografts bei immundefizienten Mäusen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patienten-abgeleitete Xenografts sind eine innovative Möglichkeit, Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische Studien durchzuführen. Die hier beschriebene Methode zur Herstellung von Skelettmuskel-Xenografts ist schnell, unkompliziert und reproduzierbar. Einseitige Operationen können in 15 bis 25 Minuten oder bilateral in 30 bis 40 Minuten durchgeführt werden. Bilaterale Xenografts können zusätzliche experimentelle Flexibilität bieten. Zum Beispiel können Forscher eine lokalisierte Behandlung eines Xenog…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Myositis Association und der Peter Buck Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Yuanfan Zhang für den Austausch ihrer Expertise und Ausbildung in der Xenograft-Chirurgietechnik.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Referências
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