प्रतिरक्षा कमी चूहे में मानव कंकाल मांसपेशी Xenografts प्रदर्शन
Summary
जटिल मानव रोगों पारंपरिक प्रयोगशाला मॉडल प्रणालियों में मॉडल के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यहाँ, हम प्रतिरक्षा की कमी चूहों में मानव कंकाल मांसपेशी बायोप्सी के प्रत्यारोपण के माध्यम से मानव मांसपेशियों की बीमारी मॉडल के लिए एक शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण का वर्णन.
Abstract
पशु अध्ययन में मनाया उपचार प्रभाव अक्सर नैदानिक परीक्षणों में recapitulated किया जा करने के लिए असफल. हालांकि इस समस्या बहुमुखी है, इस विफलता के लिए एक कारण अपर्याप्त प्रयोगशाला मॉडल का उपयोग है. यह पारंपरिक प्रयोगशाला जीवों में जटिल मानव रोगों मॉडल के लिए चुनौतीपूर्ण है, लेकिन इस मुद्दे को मानव xenografts के अध्ययन के माध्यम से दरकिनार किया जा सकता है. शल्य चिकित्सा विधि हम यहाँ का वर्णन मानव कंकाल मांसपेशी xenografts के निर्माण के लिए अनुमति देता है, जो मॉडल मांसपेशियों की बीमारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पूर्व नैदानिक चिकित्सीय परीक्षण बाहर ले जाने के लिए. एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत, कंकाल की मांसपेशी नमूने रोगियों से प्राप्त कर रहे हैं और फिर NOD-Rag1नलआईएल2आरजेडनल (एनआरजी) मेजबान चूहों में प्रत्यारोपित. इन चूहों परिपक्व लिम्फोसाइटों बनाने के लिए अपनी असमर्थता के कारण प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए आदर्श मेजबान हैं और इस प्रकार सेल मध्यस्थता और हास्य अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विकसित करने में असमर्थ हैं. मेजबान चूहों आइसोफ्लुरेन के साथ anaesthetized कर रहे हैं, और माउस tibialis पूर्वकाल और एक्स्टेंजर digitorum longus मांसपेशियों को हटा रहे हैं. मानव मांसपेशियों का एक टुकड़ा तो खाली tibial डिब्बे में रखा जाता है और peroneus longus मांसपेशियों के निकट और दूर tendons के लिए सीवन. xenografted मांसपेशी स्वतः संवहनी और माउस मेजबान द्वारा innervated है, मजबूत पुनर्जीवित मानव मांसपेशियों है कि पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं में जिसके परिणामस्वरूप.
Introduction
यह सूचित किया गया है कि नैदानिक परीक्षणों से गुजरने वाले सभी औषध विकास कार्यक्रमों में से केवल 13.8% ही सफल रहे हैं और अनुमोदित चिकित्सा1के लिए नेतृत्व कर रहे हैं . हालांकि इस सफलता की दर 10.4% पहले2की सूचना से अधिक है, वहाँ अभी भी सुधार के लिए महत्वपूर्ण जगह है. नैदानिक परीक्षणों की सफलता दर को बढ़ाने के लिए एक दृष्टिकोण पूर्व नैदानिक अनुसंधान में इस्तेमाल प्रयोगशाला मॉडल में सुधार करने के लिए है। खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) पशु अध्ययन उपचार प्रभावकारिता दिखाने के लिए और चरण 1 नैदानिक परीक्षणों से पहले विषाक्तता का आकलन करने की आवश्यकता है. तथापि, पशु अध्ययन और नैदानिकपरीक्षणों केबीच उपचार परिणामों में अक्सर सीमित सामंजस्य होता है 3 . इसके अलावा, पूर्व नैदानिक पशु अध्ययन के लिए की जरूरत रोगों है कि एक स्वीकार किए जाते हैं पशु मॉडल है, जो अक्सर दुर्लभ या छिटपुट रोगों के लिए मामला है की कमी में चिकित्सीय विकास के लिए एक दुर्गम बाधा हो सकता है.
मानव रोग के मॉडल के लिए एक तरीका है मानव ऊतक इम्यूनोन्यूमेंड चूहों में प्रत्यारोपण के लिए exografts उत्पन्न करने के लिए है. वहाँ xenograft मॉडल के लिए तीन प्रमुख लाभ कर रहे हैं: सबसे पहले, वे जटिल आनुवंशिक और epigenetic असामान्यताएं है कि मानव रोग है कि अन्य पशु मॉडल में reproduible कभी नहीं हो सकता है में मौजूद recapitulate कर सकते हैं. दूसरा, यदि रोगी के नमूने उपलब्ध हैं तो दुर्लभ या छिटपुट रोगों को मॉडल करने के लिए विदेशी खाद्य पदार्थों का उपयोग किया जा सकता है। तीसरा, xenografts विवो प्रणाली में एक पूर्ण भीतर रोग मॉडल. इन कारणों के लिए, हम hypothesize कि उपचार प्रभावकारिता exeograft मॉडल में परिणाम रोगियों में परीक्षण करने के लिए अनुवाद करने के लिए और अधिक होने की संभावना है. मानव ट्यूमर xenografts पहले से ही सफलतापूर्वक कई myeloma सहित आम कैंसर के लिए उपचार विकसित करने के लिए उपयोग किया गया है, साथ ही व्यक्तिगत रोगियों के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा4,5,6, 7.
हाल ही में, xexografts मानव मांसपेशियों की बीमारी8का एक मॉडल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस मॉडल में, मानव मांसपेशी बायोप्सी नमूनों इम्यूनोडेफिडेफिकेशिंग एनआरजी चूहों के हिंदलिंम में प्रतिरोपित करने के लिए xenografts फार्म कर रहे हैं. प्रतिरोपित मानव मायोफाइबर मर जाते हैं, लेकिन विदेशी भाषा में मौजूद मानव मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं को बाद में विस्तार और नए मानव मायोफाइबर में अंतर है जो engrafted मानव बेसल पटल repopulate. इसलिए, इन xenografts में पुनर्जीवित मायोफाइबर पूरी तरह से मानव हैं और स्वतः revascularized और माउस मेजबान द्वारा innervated हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि fascioscapulohumeral मांसपेशियों dystrophy (FSHD) रोगी मांसपेशियों के ऊतकों चूहों में प्रत्यारोपित मानव रोग की प्रमुख विशेषताओं recapitulates, अर्थात् DUX4 प्रतिलेखन कारक8की अभिव्यक्ति . FSHD DUX4 के overexpression के कारण होता है, जो epigenetically सामान्य मांसपेशियों के ऊतकों में मौन है9,10. FSHD xenograft मॉडल में, एक DUX4-विशिष्ट morpholino के साथ उपचार सफलतापूर्वक DUX4 अभिव्यक्ति और समारोह को दबाने के लिए दिखाया गया है, और FSHD रोगियों11के लिए एक संभावित चिकित्सीय विकल्प हो सकता है. इन परिणामों से पता चलता है कि मानव मांसपेशियों xenografts मॉडल मानव मांसपेशियों की बीमारी और चूहों में संभावित उपचार का परीक्षण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण हैं. यहाँ, हम प्रतिरक्षा की कमी चूहों में मानव कंकाल मांसपेशी xenografts बनाने के लिए शल्य चिकित्सा विधि विस्तार से वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगी व्युत्पन्न xenografts मांसपेशियों की बीमारी मॉडल और पूर्व नैदानिक अध्ययन बाहर ले जाने के लिए एक अभिनव तरीका है। कंकाल की मांसपेशी xenografts बनाने के लिए यहाँ वर्णित विधि तेजी से, सीधा, और reproduible है. एकपक्षीय सर्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Myositis एसोसिएशन और पीटर बक फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था. हम डॉ युआनफान झांग को उसकी विशेषज्ञता और जेनोग्रैफ्ट सर्जिकल तकनीक में प्रशिक्षण साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Referências
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