Utføre menneskelige Skjelettmuskel Xenotransplantater i Immunodeficient mus
Summary
Komplekse menneskelige sykdommer kan være utfordrende å modellere i tradisjonelle laboratorie modellsystemer. Her beskriver vi en kirurgisk tilnærming til modell menneskelige muskel sykdom gjennom transplantasjon av menneskelige skjelettlidelser muskel biopsier inn immunodeficient mus.
Abstract
Behandlingseffekter observert i dyrestudier ofte ikke sammenfattet i kliniske studier. Selv om dette problemet er mangesidig, er en årsak til denne feilen bruk av utilstrekkelige laboratorie modeller. Det er utfordrende å modellere komplekse menneskelige sykdommer i tradisjonelle laboratorie organismer, men dette problemet kan omgås gjennom studiet av menneskelig xenotransplantater. Den kirurgiske metoden vi beskriver her gir mulighet for etablering av menneskelige skjelettlidelser muskel xenotransplantater, som kan brukes til å modellere muskel sykdom og å gjennomføre prekliniske terapeutisk testing. Under en institusjonell gjennomgang Board (IRB)-godkjent protokoll, skjelettlidelser muskel prøver er ervervet fra pasienter og deretter transplantert inn NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) vert mus. Disse musene er ideelle verter for transplantasjon studier på grunn av deres manglende evne til å gjøre modne lymfocytter og er således ikke i stand til å utvikle celle-mediert og humoral adaptive immunresponser. Host mus er anesteserte med isoflurane, og musen tibialispuls fremre og extensor senen Longus musklene er fjernet. Et stykke av Human muskelen er så oppstilt inne det tom emballasje tibial avlukke og sutured å det proksimale og tømme sener av det peroneus Longus muskelen. Den xenografted muskelen er spontant vascularized og innervated av musen vert, noe som resulterer i robust generert menneskelig muskel som kan tjene som en modell for prekliniske studier.
Introduction
Det har blitt rapportert at bare 13,8% av alle narkotika utviklingsprogrammer gjennomgår kliniske studier er vellykket og føre til godkjent behandling1. Selv om denne suksessen rate er høyere enn 10,4% tidligere rapportert2, er det fortsatt betydelige rom for forbedring. En tilnærming for å øke suksessraten for kliniske studier er å forbedre laboratorie modeller som brukes i prekliniske forskning. Food and Drug Administration (FDA) krever dyrestudier for å vise behandlingseffekt og vurdere toksisitet før fase 1-kliniske studier. Det er imidlertid ofte begrenset overensstemmelse i behandlingsresultatene mellom dyrestudier og kliniske studier3. I tillegg, behovet for prekliniske dyrestudier kan være en umulig barriere for terapeutisk utvikling i sykdommer som mangler en akseptert dyremodell, som ofte er tilfelle for sjeldne eller sporadiske sykdommer.
En måte å modellere menneskelig sykdom er ved å transplantere menneskelig vev i immunodeficient mus for å generere xenotransplantater. Det er tre viktige fordeler ved xenograft modeller: for det første kan de recapitulate de komplekse genetiske og epigenetic unormalt som finnes i menneskelig sykdom som kanskje aldri kan reproduseres i andre dyremodeller. For det andre kan xenotransplantater brukes til å modellere sjeldne eller sporadiske sykdommer hvis pasientprøvene er tilgjengelige. For det tredje, xenotransplantater modellere sykdommen innenfor et komplett in vivo-system. Av disse grunner hypothesize vi at behandlingseffekten resulterer i xenograft modeller er mer sannsynlig å oversette til studier hos pasienter. Human svulst xenotransplantater har allerede blitt utnyttet til å utvikle behandlinger for vanlige kreftformer, inkludert flere myelom, samt personlig behandling for individuelle pasienter4,5,6, 7i.
Nylig har xenotransplantater blitt brukt til å utvikle en modell av menneskelig muskel sykdom8. I denne modellen, menneskelige muskel biopsi prøvene er transplantert inn i hindlimbs av immunodeficient NRG mus å danne xenotransplantater. Det transplantert Human myofibers dø, bortsett fra Human muskelen stilk celler gave inne det xenograft heretter utfolde og skille ut i ny Human myofibers hvilke gjenbefolke det engrafted Human basal lamina. Derfor, den genereres myofibers i disse xenotransplantater er helt menneskelig og er spontant revascularized og innervated av musen verten. Viktigere, fascioscapulohumeral muskuløse dystrofi (FSHD) pasient muskel vev transplantert til mus viser viktige funksjoner i den menneskelige sykdommen, nemlig uttrykk for DUX4 transkripsjon faktor8. FSHD er forårsaket av overuttrykte av DUX4, som er epigenetically taushet i normal muskel vev9,10. I FSHD xenograft-modellen har behandling med en DUX4-spesifikk morpholino vist å kunne undertrykke DUX4 uttrykk og funksjon, og kan være et mulig terapeutisk alternativ for FSHD pasienter11. Disse resultatene viser at menneskelige muskel xenotransplantater er en ny tilnærming til modell menneskelige muskel sykdom og teste potensielle terapier i mus. Her beskriver vi i detalj den kirurgiske metoden for å skape menneskelige Skjelettmuskel xenotransplantater i immunodeficient mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasient-avledet xenotransplantater er en innovativ måte å modellere muskel sykdom og gjennomføre prekliniske studier. Metoden er beskrevet her for å lage skjelettlidelser muskel xenotransplantater er rask, grei, og reproduserbar. Ensidige operasjoner kan utføres i 15 til 25 minutter, eller bilateralt i 30 til 40 minutter. Bilaterale xenotransplantater kan gi ekstra eksperimentell fleksibilitet. For eksempel kan forskerne utføre lokaliserte behandling av en xenograft, med den andre venstre som en kontroll. NRG-mus e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av The myositt Association og Peter Buck Foundation. Vi vil gjerne takke Dr. Yuanfan Zhang for å dele sin ekspertise og opplæring i xenograft kirurgisk teknikk.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Referências
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
