Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes
Summary
Doenças humanas complexas podem ser desafiadoras para modelar em sistemas de modelos laboratoriais tradicionais. Aqui, nós descrevemos uma aproximação cirúrgica para modelar a doença do músculo humano com a transplantação de biópsias humanas do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.
Abstract
Os efeitos do tratamento observados em estudos em animais muitas vezes não conseguem ser recapitulados em ensaios clínicos. Embora esse problema seja multifacetado, uma razão para essa falha é o uso de modelos laboratoriais inadequados. É desafiador modelar doenças humanas complexas em organismos laboratoriais tradicionais, mas esta questão pode ser contornada através do estudo de xenoenxertos humanos. O método cirúrgico que descrevemos aqui permite a criação de xenoenxertos de músculo esquelético humano, que podem ser usados para modelar a doença muscular e realizar testes terapêuticos pré-clínicos. um Conselho de revisão institucional (IRB)-protocolo aprovado, espécimes de músculo esquelético são adquiridos de pacientes e, em seguida, transplantados em NOD-Rag1NULLIL2rγNULL (NRG) hospedeiro camundongos. Esses camundongos são hospedeiros ideais para estudos de transplante devido à sua incapacidade de fazer linfócitos maduros e, portanto, não conseguem desenvolver respostas imunes adaptáveis mediadas por células e humorais. Camundongos hospedeiros são anestesiados com isoflurano, e os músculos do rato tibial anterior e extensor dos dedos longos são removidos. Uma parte do músculo humano é colocada então no compartimento tibial vazio e suturada aos tendões proximal e longe do ponto de origem do músculo do longo do peroneus. O músculo xenografado é espontaneamente vascularizado e inervado pelo hospedeiro do camundongo, resultando em músculo humano regenerado de forma robusta que pode servir de modelo para estudos pré-clínicos.
Introduction
Tem sido relatado que apenas 13,8% de todos os programas de desenvolvimento de medicamentos submetidos a ensaios clínicos são bem-sucedidos e levam a terapias aprovadas1. Quando esta taxa de sucesso for mais elevada do que os 10,4% relatados previamente2, há ainda uma sala significativa para a melhoria. Uma abordagem para aumentar a taxa de sucesso dos ensaios clínicos é melhorar os modelos laboratoriais utilizados na investigação pré-clínica. A administração de alimentos e drogas (FDA) requer estudos em animais para demonstrar a eficácia do tratamento e avaliar a toxicidade antes dos ensaios clínicos de fase 1. No entanto, muitas vezes há concordância limitada nos desfechos de tratamento entre estudos em animais e ensaios clínicos3. Além disso, a necessidade de estudos pré-clínicos em animais pode ser uma barreira intransponível para o desenvolvimento terapêutico em doenças que não têm um modelo animal aceito, o que geralmente é o caso de doenças raras ou esporádicas.
Uma maneira de modelar a doença humana é transplantar o tecido humano em camundongos imunodeficientes para gerar xenoenxertos. Existem três principais vantagens para os modelos de Xenoenxerto: primeiro, eles podem recapitular as complexas anormalidades genéticas e epigenéticas que existem na doença humana que podem nunca ser reprodutíveis em outros modelos animais. Em segundo, os xenoenxertos podem ser usados para modelar doenças raras ou esporádicas se as amostras do paciente estiverem disponíveis. Terceiro, os xenoenxertos modelam a doença dentro de um sistema completo in vivo. Por estas razões, nós supor que os resultados da eficácia do tratamento em modelos do xenograft são mais prováveis traduzir aos testes nos pacientes. Os xenoenxertos de tumores humanos já foram utilizados com sucesso para desenvolver tratamentos para cânceres comuns, incluindo mielomamúltiplo, bemcomo terapias personalizadas para pacientes individuais4,5,6, o 7.
Recentemente, os xenoenxertos têm sido usados para desenvolver um modelo de doença muscular humana8. Neste modelo, os espécimes humanos da biópsia do músculo são transplantados nos hindmembros de ratos immunodeficientes de NRG para dar forma a xenoenxertos. Os myofibers humanos transplantados morrem, mas as pilhas de haste humanas do músculo atuais no xenograft expandem subseqüentemente e diferenciam-se em myofibers humanos novos que repovoam o lamina básico humano enxertado. Conseqüentemente, os myofibers regenerados nestes xenoenxertos são inteiramente humanos e são revascularizados espontâneamente e inervado pelo anfitrião do rato. Importante, o tecido muscular do paciente da distrofia muscular fascioscapulohumeral (FSHD) transplantado em ratos recapitula características chaves da doença humana, a saber expressão do fator8da transcrição DUX4 . A FSHD é causada pela superexpressão de DUX4, que é epigeneticamente silenciada no tecido muscular normal9,10. No modelo de FSHD xenograft, o tratamento com um morfolino DUX4-specific foi mostrado para reprisificar com sucesso DUX4 expressão e função, e pode ser uma opção terapêutica potencial para pacientes de FSHD11. Estes resultados demonstram que os xenoenxertos do músculo humano são uma aproximação nova para modelar a doença do músculo humano e para testar terapias potenciais nos ratos. Aqui, nós descrevemos em detalhe o método cirúrgico para criar xenoenxertos humanos do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os xenoenxertos derivados do paciente são uma forma inovadora de modelar a doença muscular e realizar estudos pré-clínicos. O método descrito aqui para criar xenoenxertos do músculo esqueletal é rápido, direto, e reprodutível. Cirurgias unilaterais podem ser realizadas em 15 a 25 minutos, ou bilateralmente em 30 a 40 minutos. Os xenoenxertos bilaterais podem fornecer flexibilidade experimental adicional. Por exemplo, os pesquisadores podem realizar o tratamento localizado de um Xenoenxerto, com a outra esquerda …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Associação de myositis e pela Fundação de Peter Buck. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Yuanfan Zhang por compartilhar sua expertise e treinamento na técnica cirúrgica do xenograft.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Referências
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
