Выполнение человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей
Summary
Сложные заболевания человека могут быть сложными для моделирования в традиционных системах лабораторных моделей. Здесь мы описываем хирургический подход к модели человеческой мышечной болезни путем трансплантации биопсии скелетных мышц человека на иммунодефицитных мышей.
Abstract
Эффекты лечения, наблюдаемые в исследованиях на животных, часто не подводятся в клинических испытаниях. Хотя эта проблема является многогранной, одной из причин этой неудачи является использование неадекватных лабораторных моделей. Смоделировать сложные заболевания человека в традиционных лабораторных организмах сложно, но этот вопрос можно обойти путем изучения ксенотрансплантатов. Хирургический метод, который мы описываем здесь, позволяет создать келетальные мышечные ксенотрансплантаты, которые могут быть использованы для моделирования мышечных заболеваний и проведения доклинических терапевтических испытаний. В соответствии с утвержденным Институциональным наблюдательным советом (IRB) протоколом, образцы скелетных мышц приобретаются у пациентов, а затем пересаживаются в НОД-Rag1nullIL2r null (NRG) хозяйских мышей. Эти мыши являются идеальными хозяевами для трансплантации исследований из-за их неспособности сделать зрелые лимфоциты и, таким образом, не в состоянии развивать клеточные опосредовано и гуморальные адаптивные иммунные реакции. Мышей-хозяев обезврежывают изофлюраном, а мышь tibialis передняя и разгибающая дигенорора длинные мышцы удаляются. Кусок человеческой мышцы затем помещается в пустой отсек tibial и зашивается на проксимальных и дистальных сухожилий peroneus longus мышцы. Ксенотрансплантная мышца спонтанно васкуляризована и иннерватируется хозяином мыши, что приводит к активному регенерированию человеческой мышцы, которая может служить моделью для доклинических исследований.
Introduction
Было сообщено, что только 13,8% всех программ разработки лекарственных средств, проходящих клинические испытания являются успешными и привести к утвержденным терапии1. Хотя этот показатель успеха выше, чем 10,4% ранее сообщалось2, есть еще значительные возможности для совершенствования. Одним из подходов к повышению успешности клинических испытаний является совершенствование лабораторных моделей, используемых в доклинических исследованиях. Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) требует проведения исследований на животных, чтобы показать эффективность лечения и оценить токсичность до фазы 1 клинических испытаний. Тем не менее, часто ограничено согласование в исходах лечения между исследованиями на животных и клинических испытаний3. Кроме того, необходимость в доклинических исследованиях на животных может быть непреодолимым барьером для терапевтического развития при заболеваниях, в которых отсутствует принятая модель животных, что часто характерно для редких или спорадических заболеваний.
Один из способов моделирования человеческих заболеваний путем трансплантации человеческих тканей в иммунодефицитных мышей для создания ксенотрансплантатов. Есть три ключевых преимущества ксенотрансплантата модели: Во-первых, они могут резюмировать сложные генетические и эпигенетические аномалии, которые существуют в болезни человека, которые никогда не могут быть воспроизводимы в других животных моделей. Во-вторых, ксенотранспланты могут быть использованы для моделирования редких или спорадических заболеваний, если у пациента имеются образцы. В-третьих, ксенотранспланты моделируют болезнь в рамках полной системы in vivo. По этим причинам, мы предполагаем, что эффективность лечения приводит к ксенотрансплантат модели, скорее всего, перевести на испытания у пациентов. Ксенотранспланты опухоли человека уже успешно используются для разработки методов лечения распространенных видов рака, включая множественную миелому, а также персонализированные методы лечения для отдельных пациентов4,5,6, 7.
В последнее время, ксенотранспланты были использованы для разработки модели болезни человеческих мышц8. В этой модели, образцы биопсии мышц человека пересаживаются в задние конечности иммунодефицитных мышей NRG для формирования ксенотрансплантатов. Пересаженные человеческие миофибы умирают, но стволовые клетки человеческих мышц, присутствующие в ксенотрансплантате, впоследствии расширяются и дифференцируются в новые человеческие миофибы, которые заселяют привяженную человеческую базальную ламину. Таким образом, регенерированные миофибы в этих ксенотрансплантах полностью человеческие и спонтанно реваскуляризованы и иннерватированы хозяином мыши. Важно отметить, что фасциоскапуглогумеральная мышечная дистрофия (ФСХР) мышечной ткани пациента, пересаженная мышам, перезывает на мышей ключевые особенности болезни человека, а именно выражение фактора транскрипции DUX4 8. FSHD вызвано переэкспрессией DUX4, который эпигенетически заглушается в нормальной мышечной ткани9,10. В модели FSHD xenograft, лечение с DUX4-специфический морфолино было показано, успешно подавлять DUX4 выражение и функции, и может быть потенциальным терапевтическим вариантом для пациентов FSHD11. Эти результаты показывают, что человеческие мышцы ксенотрансплантатов являются новым подходом к модели человеческой мышечной болезни и проверить потенциальные методы лечения у мышей. Здесь мы подробно описываем хирургический метод создания ксенотрансплантатов скелетных мышц у иммунодефицитных мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кшенотрансплантаты, полученные из пациента, являются инновационным способом моделирования заболеваний мышц и проведения доклинических исследований. Метод, описанный здесь для создания скелетных мышечных ксенотрансплантатов, является быстрым, простым и воспроизводимым. Односторонн…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Ассоциацией миозита и Фондом Питера Бака. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Yuanfan Чжан для обмена своим опытом и обучение в ксенотрансплантат хирургической техники.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Referências
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
