Utföra humana skelettmuskulaturen xenografts hos Immunobristfällig möss
Summary
Komplexa mänskliga sjukdomar kan vara utmanande att modellera i traditionella laboratoriemodell system. Här beskriver vi en kirurgisk metod för att modellera människans muskelsjukdom genom transplantation av mänskliga skelettmuskulaturen biopsier till immunobristfällig möss.
Abstract
Behandlingseffekter som observerats i djurstudier misslyckas ofta att rekapitueras i kliniska prövningar. Även om detta problem är mångfacetterat, en orsak till detta misslyckande är användningen av otillräckliga laboratorie modeller. Det är utmanande att modellera komplexa mänskliga sjukdomar i traditionella laboratorieorganismer, men denna fråga kan kringgås genom studiet av mänskliga xenografts. Den kirurgiska metod som vi beskriver här gör det möjligt för skapandet av mänskliga skelettmuskulaturen xenografts, som kan användas för att modellera muskelsjukdom och utföra prekliniska terapeutiska tester. Enligt en institutionell granskningsnämnd (IRB)-godkänt protokoll, skelettmuskulaturen prover förvärvas från patienter och sedan transplanteras in NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) värd möss. Dessa möss är idealiska värdar för transplantations studier på grund av deras oförmåga att göra mogna lymfocyter och är därmed oförmögna att utveckla Cell-medierad och humorala adaptiva immunsvar. Värd möss bedövas med isofluran, och musen tibialis anterior och extensor digitorum longus muskler avlägsnas. En bit av mänsklig muskel placeras sedan i den tomma Tibia facket och sys till proximala och distala senor i peroneus longus muskeln. Den xenografted muskeln är spontant vaskulariserad och innerveras av mus värden, vilket resulterar i robust regenererad mänsklig muskel som kan fungera som en modell för prekliniska studier.
Introduction
Det har rapporterats att endast 13,8% av alla läkemedelsutveckling program som genomgår kliniska prövningar är framgångsrika och leda till godkända terapier1. Även om denna framgång är högre än 10,4% tidigare rapporterat2, det finns fortfarande betydande utrymme för förbättringar. En metod för att öka andelen framgångsrika kliniska prövningar är att förbättra laboratorie modeller som används i preklinisk forskning. Food and Drug Administration (FDA) kräver djurstudier för att Visa behandlingseffekt och bedöma toxicitet före fas 1 kliniska prövningar. Emellertid, det finns ofta begränsad konkordans i behandlingsresultat mellan djurstudier och kliniska prövningar3. Dessutom kan behovet av prekliniska djurstudier vara ett oöverstigligt hinder för terapeutisk utveckling vid sjukdomar som saknar en accepterad djurmodell, vilket ofta är fallet för sällsynta eller sporadiska sjukdomar.
Ett sätt att modellera människans sjukdom är genom att transplanterar mänsklig vävnad till immunobristfälliga möss för att generera xenografter. Det finns tre viktiga fördelar med xenograft modeller: för det första kan de recapitulate de komplexa genetiska och epigenetiska avvikelser som finns i mänskliga sjukdomar som aldrig kan reproduceras i andra djurmodeller. För det andra kan xenografter användas för att modellera sällsynta eller sporadiska sjukdomar om patientprover finns tillgängliga. För det tredje, xenograft modellera sjukdomen inom ett komplett in vivo-system. Av dessa skäl, vi hypotes om att behandlingseffekt resultat i xenograft modeller är mer benägna att översätta till prövningar hos patienter. Human tumör xenograft har redanframgångsrikt utnyttjas för att utveckla behandlingar för vanliga cancerformer, inklusive multipelt myelom, samt individanpassade terapier för enskilda patienter4,5,6, 7.
Nyligen har xenograft använts för att utveckla en modell av mänsklig muskelsjukdom8. I denna modell, mänskliga muskelbiopsi prover transplanteras in i bakbenen av immunobristfällig NRG möss att bilda xenografts. Den transplanterade humana myofibers dör, men mänskliga muskelstamceller som finns i xenograft senare expandera och differentiera till nya humana myofibers som återbefolkar den inympade mänskliga basal lamina. Därför är regenererad myofibers i dessa xenograft helt mänskliga och spontant revaskularized och innerveras av mus värden. Viktigt, fascioscapulohumeral muskeldystrofi (FSHD) patientens muskelvävnad transplanteras till möss recapitulates viktiga egenskaper hos den mänskliga sjukdomen, nämligen uttrycket av DUX4 transkriptionsfaktorn8. Fshd orsakas av överuttryck av DUX4, som är epigenetiskt tystas i normal muskelvävnad9,10. I fshd xenograft-modellen har behandling med en DUX4-specifik morfolino visat sig framgångsrikt förtränga DUX4 uttryck och funktion, och kan vara ett potentiellt terapeutiskt alternativ för fshd-patienter11. Dessa resultat visar att humana muskelxenografter är en ny metod för att modellera människans muskelsjukdom och testa potentiella terapier hos möss. Här beskriver vi i detalj den kirurgiska metoden för att skapa mänskliga skelettmuskulaturen xenograft hos immunobristfälliga möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenograft från patient är ett innovativt sätt att modellera muskelsjukdomar och genomföra prekliniska studier. Den metod som beskrivs här för att skapa skelettmuskulaturen xenograft är snabb, okomplicerad, och reproducerbara. Ensidiga operationer kan utföras i 15 till 25 minuter, eller bilateralt i 30 till 40 minuter. Bilaterala xenograft kan ge ytterligare experimentell flexibilitet. Till exempel kan forskare utföra lokaliserad behandling av en xenograft, med den andra kvar som en kontroll. Den NRG möss är re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Myositis Association och Peter Buck Foundation. Vi skulle vilja tacka Dr Yuanfläkt Zhang för att dela sin expertis och utbildning i xenograft kirurgisk teknik.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Referências
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
