Summary
这里介绍了微生物诱导的方解石沉淀（MICP）技术，通过浸泡改善土壤性能。
Abstract
本文旨在开发一种浸入法，以改善微生物诱导方解石沉淀（MICP）处理样品。组装了一批反应器，将土壤样品浸入水泥介质中。凝固介质可以自由扩散到批次反应器中的土壤样品中，而不是注入水泥介质。使用全接触柔性模具、刚性全接触模具和芯砖模具来制备不同的土壤样品支架。选择合成纤维和天然纤维来强化MICP处理的土壤样品。测量了MICP处理样品不同区域的沉淀CaCO3。CaCO3分布结果表明，沉淀的CaCO3采用浸入法在土壤样品中均匀分布。
Introduction
微生物诱导方解石沉淀（MICP）作为一种生物地面改良技术，能够提高土壤的工程性能。它用于增强土壤的强度、刚度和渗透性。MICP技术在土壤改良方面得到了全世界1、2、3、4的高度重视。碳酸盐降水自然发生，并且可能由土壤环境原生的非致病生物诱发。MICP生物地球化学反应是由尿素细菌、尿素和富含钙的溶液5、6的驱动。孢子菌糊化是一种高度活跃的尿酶，能催化方解石7、8的沉淀反应网络。尿素水解工艺产生溶解铵（NH4+）和无机碳酸盐（CO32-）。碳酸盐离子与钙离子发生反应，作为碳酸钙晶体沉淀。尿素水解反应如下所示：
沉淀的CaCO3可以将沙粒粘合在一起，提高MICP处理土壤的工程性能。MICP技术已应用于各种应用，如提高土壤的强度和刚度，修复混凝土，以及环境修复9，10，11，12，13,14,15.
赵等人16日研制出一种浸没方法制备MICP处理的样品。该方法采用土工纺织品制成的全接触柔性模具。沉淀的CaCO3均匀地分布在其MICP处理的样品中。Bu等人17开发出一种刚性全接触模具，通过浸入法制备MICP处理的光束样品。使用刚性全接触模具制备的 MICP 处理样品可形成合适的梁形。将MICP处理的样品分为4个，并测量CaCO3含量。按重量计，CaCO3含量从 8.4 ± 1.5% 到 9.4 ± 1.2% 不等，这表明 CaCO3通过浸没方法均匀分布于 MICP 处理的样品中。这些MICP处理样品也实现了更好的机械性能。这些MICP处理的生物标本达到950 kPa的弯曲强度，类似于20-25%的水泥处理样品（600-1300 kPa）。Li等人10将随机分布的离散纤维加入沙土中，采用MICP浸入法对土壤进行处理。他们发现，通过添加适当的纤维，可明显增强MICP处理土壤的剪切强度、延展性和失效应变。
MICP的浸入法已经不断改进10，16，17。该方法可用于制备 MICP 处理的土壤样品和 MICP 处理的预制建筑材料，如砖块和横梁。开发了样品制备模具的不同几何尺寸。在MICP处理的样品中加入纤维，以提高其性能。此详细协议旨在记录 MICP 治疗的浸入式方法。
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Protocol
注：以下程序中使用的所有相关材料均无危险。个人防护设备（安全眼镜、手套、实验室外套、全长裤子、闭趾鞋）仍需要。
1. 细菌溶液的制备
- 培养介质的准备（NH4-YE介质）
注：每升去离子水生长培养基的成分为：20克酵母提取物;10 g 的 （NH4）2SO4;和 0.13 M Tris 缓冲液 （pH 9.0）。- 高压灭菌成分分开。
- 溶解20克酵母提取物，以及10克（NH4）2SO4在含有0.13 M Tris缓冲液的1 L脱离子水中。
- 使用消毒后磁性搅拌器将组件混合在一起。
- 斯波罗萨西纳帕库里的繁殖过程
注：在本实验中使用50mL离心管。- 将冷冻细菌解冻在小瓶中。
- 打开小瓶。
- 将0.1 mL的细菌悬浮液转移到具有10 mL新鲜生长培养基的离心管中。手工混合良好（接种率为1：100）。在生长培养基下重复5次细菌悬浮液。只准备一个控制管，里面有10个新鲜的生长介质。
注：冷冻/干燥过程中使用的冷冻保护剂可能会抑制原管的生长。为了保持有氧状态，管子的盖子松松地拧紧。 - 在 30°C 下以 200 rpm 的转速将所有管子孵育 48 至 72 小时。如果生长培养基在48小时后变得浑浊，停止孵育。否则，将孵育延长到最高72小时。
- 用细菌和生长培养基在4，000 x g下离心管20分钟。
- 去除上清液，用25 mL的新鲜生长介质更换，并使用涡旋机混合均匀。
- 重复步骤1.2.3-1.2.6两次，以完全刺激细菌的活动。
- 使用步骤 1.2.7 中的管中的悬浮液接种更多具有 25 mL 生长介质的管，以增强细菌的培养（接种率为 1：100）。
- 在 30°C 下以 200 rpm 的转速将所有管子孵育 48 小时。
- 用细菌和生长培养基在4，000 x g下离心管20分钟。
- 去除上清液，用新鲜的生长介质更换，并使用涡旋机混合均匀。
- 在MICP实验之前，使用新鲜的生长培养基调整细菌浓度。在 600 nm 处按悬浮液的光密度计算细菌浓度，这是使用分光光度计测量的。本实验中的 OD600为 0.6。
2. 准备凝固介质
注：在MICP处理期间，水泥培养基用于提供化学物质诱导方解石沉淀。尿素-Ca2+摩尔比为 1：1。凝固介质的化学成分如表1所示。以下步骤适用于 20 L 的 0.5 M Ca 的水泥介质。
- 在塑料盒中准备 20 L 的水。
- 在20升蒸馏水中溶解200克NH4Cl、60克营养汤、42.4克NaHCO 3、600克尿素和1470克CaCl2+2H2O。使用搅拌棒混合均匀。
3. 模具制备
- 准备全接触柔性模具 （FCFM）
注：全接触柔性模具由土工织物制成。土工具有1，689 N的拉力强度，梯形撕裂强度为667 N，明显开口尺寸为0.15毫米，水流速率为34毫米/s，厚度为1.51毫米，单位质量为200克/平方米。模具尺寸可以变化，以准备不同的样品尺寸（例如，无限压缩测试样品或直接剪切测试样品）。- 由于 FCFM 由环形部分、底部和盖组成，因此将土工纺织品切割成 FCFM 的组成部分。
- 将 FCFM 的三个部分一起缝合，如图1所示。
- 为生物砖制备刚性全接触模具 （RFCM）
注：刚性全接触模具由柔性层和刚性支架组成。柔性层由与 FCFM 相同的土工织物制成。刚性支架由聚丙烯穿孔板制成，直径为 6.35 mm 交错孔，分布在聚丙烯穿孔片上，相邻孔之间的间隙距离为 9.53 mm。一个模具由三个腔室组成，每个腔室的尺寸为177.8毫米，宽度为76.2毫米，高度为38.1毫米。RFCM 的大小可以变化，以准备不同的样本大小。刚性支架上的孔允许粘结介质自由流过柔性层。- 为刚性支架的成块准备聚丙烯穿孔板。
- 使用塑料螺钉和螺母组装刚性支架件。
- 准备土工布柔性层的组成部分。柔性层由底部和盖层组成。
- 将柔性层的底部封闭在刚性支架中。
- 将沙添加到模具中后，将柔性层盖放在沙样品顶部，然后缝合，如图2所示。
- 中空砖模具的制备
注：空心砖模包括刚性支架、柔性层和纸板管。纸板管的尺寸为 60 mm x 140 mm x 60 mm。在一个模具中包括三个造型室，本步骤中每个模具室的尺寸为 177.8 mm，宽度为 76.2 mm，高度为 38.1 mm。- 为刚性支架的组成件准备聚丙烯穿孔板。
- 在刚性支架件的底部钻孔。孔的大小为 61 mm 的直径。每个腔室中孔的位置如图 3 a所示。
- 使用塑料螺钉和螺母组装刚性支架的部件。
- 将纸板管组装在刚性支架底部的钻孔中。
- 准备土工布柔性层的组成部分。柔性层由底部和盖层组成。纸板管同一位置的柔性层上也需要孔。
- 将沙添加到模具中后，将柔性层盖放在沙样品顶部，然后缝合，如图3b所示。
4. 批次反应器的准备
注：图4所示的反应堆由塑料盒、水泥介质、样品支撑架和空气泵组成。土壤样品可以完全浸入固结介质中，而凝固介质则可自由扩散到土壤样品中。反应器中的空气泵为细菌提供氧气。为了确定不同氧气供应对由Sporosarcina pasteurii催化的MICP治疗的影响，Li等人2017年18日在三种不同条件下进行了对比测试：加气条件、空气受限条件和露天条件。他们发现，良好的氧气条件对于改善由有氧细菌催化的MICP过程至关重要。
- 使用塑料软管将空气泵与空气供应器连接。
- 将空气泵放在塑料盒中。
- 将凝固介质倒入塑料盒中。
5. 土壤样品的制备
- 米卡经处理土壤样品的制备
注：渥太华沙（99.7%石英）用于实验。沙粒尺寸中位数为0.46 mm，不含细粒。根据统一土壤分类系统（USCS），它被分类为等级差的沙。- 通过空气润滑法（FCFM、RFCM、空心砖模具）将干沙添加到模具中，达到中等致密条件（Dr在约42-55%的范围内，干型沙密度在1.58~1.64克/厘米3范围内）。
注：沙的重量因模具的不同而不同：UCS测试样品的145×5克沙，直径38.6毫米，高76.2毫米。 - 将盖放在样品顶部，然后缝制。
- 将细菌溶液通过可渗透的土工织物覆盖物以固定的光学密度值倒入样品中，并确保其饱和。
注：细菌溶液的含量因样品而异：UCS 测试样品的细菌溶液为 50 mL，直径为 38.6 mm，高度为 76.2 mm。 - 将样品放在支持的示例搁板上，如图5a所示。
- 将整个搁板浸入充满水泥介质的批次反应器中。
- 打开空气供应并调整空气输出以保持 100% 空气饱和度。等待 7 天的 MICP 反应。
- 从反应器中拿出样品，如图5b所示。
- 通过切割完全接触柔性模具或去塑硬质支架，然后切割柔性层来拆下样品。
- 用水清洗样品，取出毛孔空间中的残留溶液。
- 将样品放入 105°C 烤箱中 48 小时，直到其重量保持不变。样品可以在烤箱干燥后进行检测或处理。
- 通过空气润滑法（FCFM、RFCM、空心砖模具）将干沙添加到模具中，达到中等致密条件（Dr在约42-55%的范围内，干型沙密度在1.58~1.64克/厘米3范围内）。
- 纤维增强MICP处理土壤样品的制备
注：合成纤维（见材料表）和天然棕榈纤维，如图6所示，在这些过程中使用。- 对于合成纤维，用手以小增量混合纤维和900克干沙的拟议含量，以获得均匀的混合物。本实验中的纤维含量按干沙重量固定为0.3%。
- 对于天然棕榈纤维，将 760 g 的沙分四个相等的部分。每隔一段时间在 RFCM 中加入这四个部分的沙和三层纤维。
- 重复步骤 5.1.2_5.1.10 的相同步骤，获取 MICP 处理的样本。
- 具有生物表面处理的水泥处理砖的制备
注：波特兰水泥（TYPE I/II）的特重为3.15，用作本实验中水泥处理样品的固结剂。这种水泥的早期强度增益使各种固化时间从7天到21天不等。按干沙重量分列，加入的水泥比例为10%。- 混合 900 克沙、90 克水泥和 200 mL 的水，实现均匀的混合物。
- 将混合物添加到刚性模具中。刚性模具尺寸为177.8毫米，宽度为76.2毫米，高度为38.1毫米。
- 在恒定湿度为 100% 且恒定温度为 25°C 时固化 7 天。
- 将样品放入 105°C 烤箱 48 小时，直到其重量保持不变。
- 重复步骤 5.1.3_5.1.8 相同的步骤。
- 将样品放入 105°C 烤箱 48 小时，直到其重量保持不变。样品可以在烤箱干燥后进行检测或处理。
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Representative Results
图7显示了沉淀的CaCO3在整个MICP处理样品中的分布情况。MICP处理的样本分为三个不同的区域。用酸洗法对每个区域的CaCO3含量进行了测试。为了溶解沉淀的碳酸盐，在HCl溶液（0.1 M）中清洗干MICP处理的样品，然后冲洗、排空和烘干48小时。酸洗前后样品质量的差异值被认为是MICP处理样品中沉淀的碳酸盐的质量。CaCO3内容以样本重量的百分比表示。浸没方法采用MICP处理样品的CaCO3含量在9.0%至9.5%之间。结果表明，沉淀的CaCO3在土壤样品中均匀分布。马丁内斯等人19日在实验室用注射方法对50厘米长的沙柱进行了实验，结果发现方解石不均匀地沿着MICP处理的沙柱分布。大部分方解石在进流柱附近沉淀，阻碍了柱的较深部分的凝固反应。
图8显示了使用四点试验获得的用三层棕榈纤维和未加固生物砖加固的生物砖应力应变曲线。未加固生物砖的弯曲强度为1，150千帕，而钢筋生物砖的弯曲强度为980千帕。它们的弯曲强度相似，但通过添加棕榈纤维，弯曲应变得到显著改善。这些结果表明，棕榈纤维有助于提高延展性。
图1：用于直接剪切测试的全接触柔性模具。
全接触柔性模具由土工织物制成。土工纺织品是聚丙烯、短纤维和针打无纺布材料。圆柱形模具的直径为62毫米，高度为26毫米。请点击此处查看该图的较大版本。
图2：生物砖的样品制备。
砖装配模具;
沙加入模具;
在沙样品顶部添加柔性盖。刚性全接触模具由柔性层和刚性支架组成。柔性层由土工织物制成，刚性支架由聚丙烯穿孔板制成。模具由三个腔室组成，每个腔室的长度为177.8毫米，宽度为76.2毫米，高度为38.1毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：芯砖模具。
（a） 模具室上的孔分布;（b） 生物芯砖的样品制备，为核心砖组装模具;沙加入模具;在沙样品顶部添加柔性盖。核心砖模具包括刚性支架、柔性层和纸板管。纸板管尺寸为 60 毫米 x 140 毫米 x 60 毫米。一个模具中包括三个腔室，每个模具室的长度为177.8毫米，宽度为76.2毫米，高度为38.1毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：MICP批量反应器草图。
所有样品都准备在完全搅拌的罐式反应器中。该批反应器包括一个塑料盒，用于土壤样品和固结介质，一个磁混合器，以保持溶液的统一，以及一个空气泵，为细菌提供氧气。这种方法的一个主要特点是使土壤样品完全浸入水泥介质中，并允许凝固介质自由渗透到土壤样品中。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：放置在支撑架子上的土壤样本。
（a） 在 MICP 反应之前;（b） 在 MICP 反应之后.生物砖样品是用全接触模具制备的。在模具顶部应用了土工织物盖。每块生物砖的长度为177.8毫米，宽度为76.2毫米，高度为38.1毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：（a） 合成纤维;（b） 天然棕榈纤维。
合成纤维是一种具有0.91特异性比重的同质聚丙烯多丝纤维。它在化学上具有高耐盐性。本研究所用纤维的长度和厚度分别为12毫米和0.1毫米，纤维长度和厚度之间的纵横比为120。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：CaCO3在MICP处理样品的三个区域分布。
在示例中划分了三个区域。在每个区域中，按重量测量和计算沉淀的 CaCO3的数量。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：弯曲应力作为未增强生物砖和棕榈纤维增强生物砖的弯曲应变函数，采用MICP处理。
未加固生物砖的弯曲强度为1，150千帕，而钢筋生物砖的弯曲强度为980千帕。通过添加棕榈纤维，弯曲应变得到显著改善。这些结果表明，棕榈纤维有助于提高延展性。请点击此处查看此图的较大版本。
| 化学 | 水泥介质浓度（克/升） | |||
| 0.25 M Ca | 0.5 M Ca | 1 M Ca | 1.5 M Ca | |
| NH4Cl | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 营养汤 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| NaHCO3 | 2.12 | 2.12 | 2.12 | 2.12 |
| 尿素 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| CaCl2+2H2O | 36.8 | 73.5 | 147 | 220.5 |
表1：固井介质的化学成分。这些化学品用于制备0.25 M Ca、0.5 M Ca、1 M Ca和1.5 M Ca中的四种浓度的凝固介质。尿素-Ca2+摩尔比固定为 1：1。
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Discussion
本文提出了浸没的MICP技术。土壤样品被浸入批次反应器中，在MICP过程中被凝固介质完全渗透。在该方法中，应用全接触柔性模具、刚性全接触模具和芯砖模具制备MICP处理样品。
可针对不同的几何形状设计不同的模具。土工布纤维结构增加了沙与固结介质的接触面积，有效地增加了固结介质对土壤样品的渗透。大量的土工毛孔还使模具内部发生更多的降水，以提高MICP处理样品的强度。通过浸入法中使用这些模具，大大提高了MICP处理样品的土壤特性，如强度和方解石含量。浸入法在制备预制建筑材料（如生物砖和生物空心砖）方面显示出优势。合成纤维和天然纤维可添加到土壤中，以增强MICP处理样品。纤维添加是改进预制 MICP 处理材料的适当方法。MICP技术采用浸入法，可应用于水泥处理砖的表面处理，以提高其性能，如通过降低水泥处理材料的渗透性来提高其耐久性。然而，由于操作受限，这种浸入式方法难以在现场实现，今后需要研究如何在现场使用该方法，在该方法中应用。
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Disclosures
我们没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家科学基金会第1531382号赠款和MarTREC的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Chloride, >99% | Bio-world | 40100196-3 (705033) | |
| Ammonium Sulfate | Bio-world | 30635330-3 | |
| Calcium Chloride Dihydrate, >99% | Bio-world | 40300016-3 (705111) | |
| Nutrient Broth | Bio-world | 30620056-3 | |
| Sodium Bicarbonate, >99% | Bio-world | 41900068-3 (705727) | |
| Sporosarcina pasteurii | American Type Culture Collection | ATCC 11859 | |
| Synthetic fiber | FIBERMESH | Fibermesh 150e3 | |
| Tris-Base, Biotechnology Grade, >99.7% | Bio-world | 42020309-2 (730205) | |
| Urea, USP Grade, >99% | Bio-world | 42100008-2 (705986) | |
| Yeast Extract | Bio-world | 30620096-3 (760095) |
References
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