Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi
Summary
İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.
Abstract
Glycomics hastalık yatkınlığı, ilaç hedef keşif ve hassas tıp için yeni nesil biyobelirteçler keşfetmek önemli bir potansiyel sunan omics sistem araştırmayeni bir alt uzmanlık olduğunu. Alternatif IgG N-glikanlar çeşitli yaygın kronik hastalıklarda bildirilmiştir ve klinik uygulamalarda büyük potansiyele sahip olduğu ileri sürülmüştür (yani, hastalıkların tanı ve tahmini için biyobelirteçler). IgG N-glikanlar hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) ultra-performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) yöntemi kullanılarak yaygın olarak karakterize edilir. UPLC iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek göreli kantitatif doğruluk ile istikrarlı bir algılama teknolojisidir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır, ve glikan bileşimi ve plazmada göreceli bolluk karakterizedir.
Introduction
N-insan proteinlerinin glikozilasyon yaygın ve temel post-translational modifikasyon1 ve nispeten doğru hastalıkların oluşumu ve gelişimini tahmin yardımcı olabilir. Yapısının karmaşıklığı nedeniyle, 5.000’den fazla glikan yapısı olması beklenmektedir, hastalıklar için tanısal ve tahmine dayalı biyobelirteçler olarak büyük bir potansiyel sağlayan2. N -glikanlar immünglobulin G bağlı (IgG) IgG fonksiyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir, ve IgG N-glikozilasyon pro- ve anti-inflamatuar sistemler arasındaki dengeye katılır3. Diferansiyel IgG N-glikozilasyon hastalık gelişimi ve ilerlemesinde rol oynar ve hastalık patolojisinde yer alan yatkınlık ve fonksiyonel mekanizmayı temsil emdir. IgG N-glikozilasyon inflamatuar rolü yaşlanma ile ilişkili olmuştur, inflamatuar hastalıklar, otoimmün hastalıklar, ve kanser4.
Algılama teknolojisinin geliştirilmesi ile, aşağıdaki yöntemler en yaygın olarak yüksek iş yapma glycomics kullanılır: hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) floresan saptama ile ultra-performans sıvı kromatografisi (UPLC-FLR), lazer indüklenen flor ile multipleks kapiller jel elektroforezi eskuss algılama (xCGE-LIF), matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon zaman-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) ve sıvı kromatografi elektrosprey kütle spektrometresi (LC-ESI-MS) . Bu yöntemler düşük akı önceki eksiklikleri aşmak var, kararsız sonuçlar, ve kötü duyarlılık özgüllüğü5,6.
UPLC yaygın IgG N-glikozilasyon ve bazı hastalıklar arasındaki ilişkiyi keşfetmek için kullanılır (yani, yaşlanma7, obezite8, dislipidemi9, tip II diyabet10, hipertansiyon11, iskemik inme12, ve Parkinson hastalığı13). Yukarıda belirtilen diğer üç yöntemle karşılaştırıldığında, UPLC aşağıdakiavantajlarasahiptir 5,14. İlk olarak, göreceli bir nicel analiz yöntemi sağlar ve toplam alan normalleştirme içeren veri analizi her örnek karşılaştırılabilirliğini artırır. İkinci olarak, ekipman maliyeti ve gerekli uzmanlık nispeten düşüktür, bu da glikozilasyon biyobelirteçlerinin klinik uygulamalara uygulanmasını ve dönüştürülmesini kolaylaştırır. Daha yaygın olarak kullanılabilir böylece Burada Sunulan UPLC bir giriştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
UPLC göreceli nicel analizyöntemi5,15olarak hizmet vermektedir. Sonuçlar UPLC iyi tekrarlanabilirlik ve göreceli nicel doğruluk ile istikrarlı bir algılama teknolojisi olduğunu göstermektedir. Her tepedeki glikan miktarı, göreli değer olan UPLC kullanılarak toplam tümleşik alanın yüzdesi olarak ifade edilir. Göreli nicelik, test örneklerinin karşılaştırılabilirliğini artırır. Buna ek olarak, 96 iyi protein G plakaları yüksek iş lenme…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81673247 & 81872682) ve Avustralya-Çin İşbirlikçi Hibe (NH & MRC – APP1112767 -NSFC 81561128020) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
Referências
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson’s disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O’Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
