Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Summary

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Abstract

Zellen verwenden mehrere Methoden zum Recycling unerwünschter Proteine und anderer Materialien, einschließlich lysosomaler und nicht-lysosomaler Wege. Der Hauptlysosome-abhängige Weg wird Autophagie genannt, während die primäre nicht-lysosomale Methode für Proteinkatabolismus das Ubiquitin-Proteam-System ist. Jüngste Studien an Modellorganismen deuten darauf hin, dass die Aktivität sowohl der Autophagie als auch des Ubiquitin-Proteasom-Systems nicht täglich konstant ist, sondern je nach täglichem (zirkadianem) Rhythmus variiert. Die Fähigkeit, biologische Rhythmen im Proteinumsatz zu messen, ist wichtig, um zu verstehen, wie die zelluläre Qualitätskontrolle erreicht wird, und um die Dynamik bestimmter Proteine von Interesse zu verstehen. Hier präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll zur Quantifizierung des autophagischen und proteasomalen Flusses in vivo, das die zirkadiane Komponente des Proteinumsatzes erfasst. Unser Protokoll enthält Details zur Maushandhabung, Gewebeverarbeitung, Fraktionierung und autophagischen Flussquantifizierung mit Mausleber als Ausgangsmaterial.

Introduction

Zirkadische Rhythmen beziehen sich auf tägliche, vorhersehbare Variationen der biologischen Funktion, die in der ganzen Natur sichtbar sind. Sie existieren auf jeder biologischen Skala, von makroskopischen Verhaltensweisen wie Schlaf-Wach-Zyklen bis hin zu molekularen Phänomenen wie der rhythmischen Fülle von Biomolekülen. In den letzten Jahren hat sich die Erforschung zirkadianer Rhythmen durch die Entdeckung von “Uhrengenen” verändert, die für die zirkadiane Rhythmuserzeugung entscheidend sind. Studien an Clock-Gen-Knockout-Mäusen haben eine zentrale Rolle für zirkadiane Rhythmen bei der zeitlichen Organisation von kernzellulären Prozessen wie Stoffwechsel¹gezeigt. Zu den Möglichkeiten, wie zirkadiane Rhythmen dies ermöglichen, gehört die Vermittlung einer zeitlichen Struktur zum Proteinkatabolismus.

Mehrere Gruppen, darunter unsere, haben gezeigt, dass die beiden Hauptwege für zellulären Proteinkatabolismus, Autophagie und das Ubiquitin-Proteasom-System, den Tagesrhythmen^2,3,4,5unterliegen. Die Autophagie stellt den lysosomenabhängigen Arm des Proteinkatabolismus dar, in dem Proteine von Interesse entweder durch den Bau einer neuartigen Vesikel (Makroautophagie) oder durch direkte Translokation durch eine Kanal (Chaperon vermittelte Autophagie)⁶. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist der wichtigste nicht-lysosomale Weg, bei dem Proteine polyubiquitiniert und dann in das Proteasom eingespeist werden, eine makromolekulare Degradative Maschine, die im gesamten Zytoplasma und Kern gefunden wird^7,8. Rhythmen in autophagischer und proteasomaler Aktivität sind wichtig, weil sie wahrscheinlich eine Rolle in der zellulären Haushaltsführung spielen. Daher ist es wertvoll, ein standardisiertes Verfahren zu haben, das tägliche Schwingungen im Proteinkatabolismus erkennen kann, die mit präklinischen Krankheitsmodellen kompatibel sind.

Hier stellen wir unser Protokoll zur Quantifizierung von Tagesschwankungen im autophagischen Fluss in der Mausleber zur Verfügung, das als Grundlage für die Arbeit in unserem Labor^{diente 3,9}. Unsere Methode wird als “Umsatz-Assay”¹⁰klassifiziert, ein Ansatz, der von zahlreichen Gruppen verwendet wird, um proteolytische Aktivität (oder Fluss) zu messen. Bei diesem Ansatz werden Proteasehemmer, die für Lysosomen oder Proteasomen spezifisch sind, Mäusen verabreicht und anschließend Gewebeproben nach einem festen Zeitintervall erhalten. Parallel dazu werden Gewebeproben von Mäusen gewonnen, die Scheininjektionen unterzogen werden. Die Gewebeproben werden homogenisiert und dann biochemisch getrennt, um die lysosososomeangereicherten und zytoplasmatischen Fraktionen zu erhalten. Diese Fraktionen werden dann parallel über Western Blotting mit Antikörpern analysiert, die spezifisch für makroautophagy Marker (LC3b und p62) oder proteasomale Substrate (poly-ubiquitiniertes Protein) sind. Im Laufe der Zeit akkumulieren Tiere, die mit Proteasehemmern injiziert werden, Proteine, die normalerweise recycelt worden wären. Infolgedessen wird die Umsatzrate durch den Vergleich der Häufigkeit von Markerproteinen in den mit Protease-Hemmerbehandelten behandelten Proben mit den scheinbehandelten Proben abgeleitet. Durch die Wiederholung dieser Methode in festen Zeitintervallen über den Tag ist es möglich, zirkadiane Variationen in der Proteolyse zu rekonstruieren (Abbildung 1A).

Protocol

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Washington University in St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. 1. Mausgehäuse und experimentelles Design Um tägliche Rhythmen im Proteinumsatz zu erkennen, hause Mäuse (männlich oder weiblich C57BL/6J, 4 x 8 Wochen alt, 20-25 g) unter Standard 12 h Licht/Dunkel-Zyklen mit Lebensmitteln ad libitumzur Verfügung gestellt. Um Stress zu vermeiden, können Sie Mäuse mindestens eine Woche lang in der Anlage vo…

Representative Results

Repräsentative Daten sind in Abbildung 2A,Bdargestellt, und die Quantifizierung dieser Daten ist in Abbildung 2C,D enthalten (siehe auch Zusatzdatei “Beispieldaten”). Der Einfachheit halber haben wir die Ladesteuerungen in Abbildung 2 nicht dargestellt, aber diese sollten parallel erhalten werden. Typischerweise werden zu diesem Zweck westliche Flecken gegen das -Actin verwendet, a…

Discussion

Unser Protokoll beschreibt ein technisch unkompliziertes Mittel zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinumsatz von Mäusen mit allgemein verfügbaren molekularbiologischen Geräten. Aufgrund der Länge der Zeitreihenexperimente und der Anzahl der beteiligten biologischen Proben ist es wichtig, während des gesamten Experiments konsistent zu sein, wie die Mäuse injiziert werden, den Zeitpunkt der Gewebeaufnahme und die biochemische Verarbeitung von Proben. Die Injektions-, Euthanasie- und Zervixdislokationsschritte k…

Materials

4x SDS PAGE Sample Buffer	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b antibody	Novus	Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody	Cell Signaling Technology	Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets	Millipore-Sigma	Cat# S8830