Измерение суточных ритмов в аутофагическом и протеасомальном потоке
Summary
Мы описываем наш протокол для измерения биологических ритмов в белковом катаболизме с помощью аутофагии и протеасомы в печени мыши.
Abstract
Клетки используют несколько методов переработки нежелательных белков и других материалов, в том числе лисосомальных и нелисосомальных путей. Основной лизосомы-зависимый путь называется аутофагией, в то время как основным нелизосомным методом белкового катаболизма является система убиквитин-протеаомы. Недавние исследования в модельных организмах показывают, что активность как аутофагии, так и системы убиквитин-протеасомы не является постоянной в течение дня, а вместо этого изменяется в соответствии с ежедневным (циркадным) ритмом. Способность измерять биологические ритмы в белковом обороте важна для понимания того, как достигается контроль качества клеток, и для понимания динамики конкретных белков, представляющих интерес. Здесь мы представляем стандартизированный протокол для количественной оценки аутофагического и протеасомального потока в виво, который фиксирует циркадный компонент текучести белка. Наш протокол включает в себя детали для обработки мышей, обработки тканей, фракционирования и аутофагической количественной оценки потока с использованием печени мыши в качестве исходного материала.
Introduction
Циркадные ритмы относятся к ежедневным, предсказуемым изменениям в биологической функции, которые очевидны по всей природе. Они существуют на всех биологических масштабах, от макроскопических поведений, таких как циклы сна и бодрствования, до молекулярных явлений, таких как ритмическое изобилие биомолекул. В последние годы исследования циркадных ритмов были преобразованы открытием «генов часов», которые имеют решающее значение для поколения циркадного ритма. Исследования в часы гена нокаут мышей показали центральную роль для циркадных ритмов в временно организации основных клеточных процессов, таких как метаболизм1. Среди способов циркадных ритмов сделать это произошло путем придав височной структуры белка катаболизма.
Несколько групп, включая нашу показали, что два основных пути для клеточного белка катаболизма, аутофагии и убиквитин-протеасомы системы, подлежат суточные ритмы2,3,4,5. Аутофагия представляет лизосо-зависимую руку протеинового катаболизма, в которой белки, представляющие интерес, доставляются в эту универсательную органель либо через строительство нового везикула (макроавтофагия), либо через прямую транслокацию, хотя канал (chaperone опосредовано аутофагии)6. Убиквитин-протеасома система является основным не-лизосомный путь, где белки поли-убиквитина, а затем подается в протеасоме, макромолекулярной деградативной машины найти по всей цитоплазмы и ядра7,8. Ритмы в аутофагической и протеасомной активности имеют важное значение, поскольку они, вероятно, играют определенную роль в сотовой домашнего хозяйства. В результате, это ценно иметь стандартизированную процедуру, которая может обнаружить ежедневные колебания в катамализме белка, который совместим с доклиническими моделями болезней.
Здесь мы предоставляем наш протокол для количественной оценки суточных вариаций в аутофагном потоке в печени мыши, который послужил основой для работы в нашей лаборатории3,9. Наш метод классифицируется как “оборот ный”10, подход, используемый многочисленными группами для измерения протеолитической активности (или потока). При таком подходе ингибиторы протеазы, характерные для лизосомы или протеасомы, вводятся мышам, а затем образцы тканей получаются после фиксированного промежутка времени. Параллельно, образцы тканей получаются у мышей, подвергаемых фиктивным инъекциям. Образцы тканей гомогенизированы, а затем биохимически разделены для получения обогащенных лизоомами и цитоплазмических фракций. Эти фракции затем анализируются параллельно с помощью западных blotting с использованием антител, характерных для макроаутофагии маркеров (LC3b и p62) или протеасомальных субстратов (поли-убиквитинат белка). Со временем животные, вводимые ингибиторами протеазы, накапливают белки, которые обычно были переработаны. В результате, скорость оборота выводится путем сравнения обилия маркерных белков в протеаз-ингибитор обработанных образцов для фиктивных образцов. Повторяя этот метод с фиксированными временными интервалами в течение дня можно реконструировать циркадные вариации в протеолизах(рисунок 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш протокол описывает технически простое средство измерения биологических ритмов в белковой обороте у мышей с использованием широко доступного оборудования молекулярной биологии. Из-за продолжительности экспериментов серии времени и количества биологических образцов, участвующи?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась ЗА счет RO1HL135846 и гранта Института развития детей (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
Referências
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
