Aqui, apresentamos um protocolo de teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina.
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Artigo de método
Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma das principais modalidades de diagnóstico para raiva é a detecção do complexo de ribonucleoproteína viral (RNP) nas amostras de tecido infectado. Embora o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFA) ou o teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT) sejam mais comumente utilizados para a detecção de antígenos, ambos os testes requerem tecidos frescos e/ou congelados para impressões em lâminas antes da detecção de antígenos usando anticorpos. Se as amostras forem coletadas e fixadas em formalina, nenhum dos testes é ideal para a detecção de antígenos, no entanto, os testes podem ser realizados pela imunohistoquímica convencional (IHC) após a incorporação em blocos de parafina e secção. Com este método IHC, os tecidos são manchados com anticorpos antirraiva, seções são desparafinadas, antígenos recuperados por proteólise parcial ou outros métodos, e incubados com anticorpos primários e secundários. Os antígenos são manchados usando peroxidase de rabanete / amino etil carbazole e contra-manchados com hematoxilina para a visualização usando um microscópio leve. Além da detecção específica de antígenos, a fixação de formalina oferece outras vantagens como a determinação de alterações histológicas, condições relaxadas para armazenamento e transporte de amostras (sob temperaturas ambientes), capacidade de testar casos retrospectivos e maior segurança biológica através da inativação de agentes infecciosos.
Introdução
A raiva é uma encefalite progressiva aguda causada pelo sentido negativo vírus RNA pertencentes ao gênero lyssavirus1. Quase 99% de todas as mortes humanas causadas pela infecção pelo vírus da raiva (RABV), o tipo de membro do gênero, é transmitida por cães2. O diagnóstico de raiva de animais suspeitos baseia-se na detecção de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viral, n proteína) em complexo com RNA genômico (complexo de ribonucleoproteína, RNP) no tecido cerebral3. A detecção de antígeno pelo teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) é considerada o padrão-ouro para o diagnósti....
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Protocolo
Enquanto o protocolo IHC foi realizado em tecidos fixos de formalina, que inativam rabv se presente, protocolos de biossegurança apropriados devem ser devidamente seguidos. Todos os procedimentos de biossegurança estão descritos na Biossegurança nos Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL) 5ª Edição (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluindo o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e exigência de vacinação conforme descrito12. Além disso, deve ser seguida a contenção e manuseio adequados de produtos químicos perigosos (como formalina, AEC e xileno), (por exemplo, capuzes de fumaça).
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Resultados
A Figura 2 demonstra resultados representativos de coloração do IHC de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais testados. A Figura 2A,D,G representa amostras positivas em 200x, enquanto a Figura 2B,E,H corresponde à ampliação de 400x, respectivamente. Figura 2A-C correspondem ao tronco c.......
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Discussão
Devido à alta taxa de letalidade da raiva após o início dos sintomas, o diagnóstico de animais suspeitos para infecção por RABV é extremamente crítico para um tratamento profilático pós-exposição adequado. O diagnóstico da raiva depende principalmente de técnicas baseadas em DFA, DRIT e PCR usando tecidos frescos ou congelados. Para testes de tecidos fixos de formalina, o teste IHC fornece um método alternativo para a detecção sensível e específica do antígeno RABV. Embora os tecidos fixados em formalina tenham proteínas.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos aos laboratórios, epidemiologistas e afiliados às secretarias de saúde pública pelas submissões de amostras aos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. Os achados e conclusões deste relatório são dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. O uso de nomes comerciais e fontes comerciais são apenas para identificação e não implicam endosso pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3% de peróxido de hidrogênio | Pharamacy | Fora da prateleira 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-etilcarbazol (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Tampão de acetato pH 5.2 | Poly Scientific R& D Corp. | s140 | |
| Formalina Tamponada 10% Fosfato Tampolado | Fisher Scientific | SF100-4 | Certificado |
| Lamínulas Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Etanol 190 Prova | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Etanol 200 Prova | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Formulação de hematoxilina de Gill #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark seracare | 71-00-18 | Anticorpo Primário de Camundongo | |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mídia de montagem |
| N,N, Dimetil formamida GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objetivo | Vários fornecedores | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objetivo | Vários fornecedores | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R& D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Conjunto de manchas deslizantes | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Grau Histológico |
| Zeiss Axioplan 2 imagem - microscópio | Vários fornecedores |
Referências
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384<....
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Reimpressões e permissões
