Summary
Her præsenterer vi en immunohistochemistry testprotokol til påvisning af rabiesvirusantigen som en alternativ diagnostisk test for formalin-faste væv.
Abstract
En af de primære diagnostiske metoder for rabies er påvisning af viral ribonucleoprotein (RNP) kompleks (antigen) i de inficerede vævsprøver. Mens den direkte fluorescerende antistof (DFA) test eller direkte hurtig immunohistokemisk test (DRIT) er mest almindeligt anvendt til antigen påvisning, begge tests kræver friske og / eller frosne væv for indtryk på dias før antigen detektion ved hjælp af antistoffer. Hvis prøverne indsamles og fikses i formalin, er ingen af testene optimale til antigendetektering, men test kan udføres af konventionel immunhistochemistry (IHC) efter indlejring i paraffinblokke og afsnit. Med denne IHC-metode farves væv med anti-rabies antistoffer, sektioner er deparaffinerede, antigen hentet ved delvis proteolyse eller andre metoder og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. Antigener er plettet ved hjælp af peberrod peroxidase / amino ethyl carbazole og counterstained med hæmatoxylin til visualisering ved hjælp af et let mikroskop. Ud over den specifikke antigendetektering giver formalinfikation andre fordele som bestemmelse af histologiske ændringer, lempede betingelser for opbevaring og transport af prøver (under omgivelsestemperaturer), evne til at teste retrospektive tilfælde og forbedret biologisk sikkerhed gennem inaktivering af infektiøse agenser.
Introduction
Rabies er en akut progressiv encephalitis forårsaget af den negative følelse RNA-vira, der tilhører slægten lyssavirus1. Næsten 99% af alle dødsfald hos mennesker forårsaget af infektion med rabiesvirus (RABV), typen medlem af slægten, overføres af hunde2. Rabies diagnose af mistænkte dyr er afhængig af påvisning af antigen (primært viral kodet nukleoprotein, N protein) i kompleks med genomisk RNA (ribonucleoprotein kompleks, RNP) ihjernevævet 3. Antigendetektering ved den direkte fluorescerende antistoftest (DFA) betragtes som guldstandarden forrabiesdiagnose 4. Metoden anvender frisk eller frisk frossen hjerne materiale, et touch indtryk på et dias, fiksering i acetone, farvning ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende isothiocyanat (FITC) mærket monoklonale eller polyklonale antistoffer (mAbs / pAbs) og læses af fluorescens mikroskopi5. DFA-testen er hurtig, følsom og specifik for påvisning af rabiesantigen i frisk hjernevæv. For nylig blev en direkte hurtig immunohistokemisk test (DRIT), modificeret immunohistochemistry (IHC) teknik, demonstreret for at udvise lignende følsomhed over for DFA, men giver fordelen ved lysmikroskopi til visualisering6. Mens detektionsmetoden, der anvendes i DRIT, ligner IHC, bruger det første trin frisk eller frossen væv til at generere berøringsindtryk af prøven efterfulgt af fiksering i formalin.
IHC er en meget anvendt teknik til at bestemme histologiske ændringer og påvisning af proteiner ved hjælp af specifikke antistoffer i formalin-faste væv indlejret i paraffin blokke. IHC er en etableret alternativ test for påvisning af rabiesantigen i vævsafsnit7. IHC er især blevet brugt til diagnosticering af retrospektive tilfælde, der udviste neurologiske sygdomme til at bestemme byrden af rabies8. Paraffin-indlejret formalinfast væv bevarer proteinerne til detektion, selv efter flere år, når de opbevares ved omgivelsestemperatur9. Formalin behandling ændrer proteiner ved at krydskælle og ændre aminosyre sidekæder, hvilket kan gøre epitoperne ikke længere reaktive mod antistoffer10. Mens IHC-testen for påvisning af rabiesantigen involverer enten mAbs eller pAbs, er sidstnævnte fordelagtig, da flere epitoper og divergerende lyssavirus kan påvises11.
De standardtrin, der er involveret i IHC, er formalinfiksering af væv, indlejring i paraffinblokke, opdeling af væv, deparaffinisering og hydrering, epitopgendannelse, reaktivitet mod primære og sekundære antistoffer og udvikling ved hjælp af kromogene substrater. Dette manuskript beskriver en detaljeret redegørelse for protokollen for rabiesdiagnose. For rabies antigen påvisning, mus serum immuniseret med RABV (pAbs) genereret på den amerikanske Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, i kombination med biotinylerede anti-mus sekundære antistoffer udnyttes. Biotinylerede Abs detekteres ved tilsætning af streptavidin-peberrod peroxidase (HRP) kompleks efterfulgt af farveudviklingen med amino-ethylcarbazol substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mens IHC-protokollen blev udført på formalinfast væv, som inaktiverer RABV, hvis den er til stede, bør passende biosikkerhedsprotokoller følges korrekt. Alle biosikkerhedsprocedurer er beskrevet i biosikkerhed i mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), herunder brug af ordentlige personlige værnemidler (PPE) og vaccinationskrav som beskrevet12. Derudover bør der følges korrekt indeslutning og håndtering af farlige kemikalier (som formalin, AEC og xylen) (f.eks. røghætter).
1. Formalin fiksering af væv
- Placer 3-5 mm hjernevæv indsamlet efterobduktion 13 i 10% fosfat buffered formalin opløsning (1:20 til 1:50 væv / formalin ratio) for 24-72 h.
FORSIGTIG: Formalin er et giftigt fiksativ. - Registrer den omtrentlige vævsvægt (størrelse), vævstype (hjerneområder) og mængden af formalin. Det er vigtigt for laboratorier at dokumentere og vedligeholde optegnelser over fikseringstider.
- For længere væv opbevaring efter formalin fiksering og før forarbejdning, placere vævet i 70% ethanol.
2. Vævsbehandling
- Efter prøvefikseringen dissekerer vævet til at omfatte de vigtige hjerneområder, f.eks. tværsnit af hjernestammen, lillehjernen (3 lapper) eller hippocampus (begge hippocampi) hver skåret 3 til 5 mm tykke og placeret i forarbejdningskassetter.
- Vævskassetterne til paraffinvoksinfiltration, indlejret i paraffinblokke og sektionsopdelt (3 til 6 μm) på en mikrotom.
3. Fremstilling af materialer / Farvning retter
- Opsætning af farvningsskålen14 (Materialetabel) som vist i figur 1. Fyld hver skål med 250 mL af opløsningen.
- Fremstilling af 3-Amino-9-ethylcarbizol (AEC) substrat lageropløsning
- Opløs en 20 mg tablet med 3-amino 9-ethylcarbazol (AEC) i 5 mL N,N, dimethylformamid ved hjælp af en glaspipette.
ADVARSEL: AEC er kræftfremkaldende.
- Opløs en 20 mg tablet med 3-amino 9-ethylcarbazol (AEC) i 5 mL N,N, dimethylformamid ved hjælp af en glaspipette.
- Fremstilling af protease (f.eks. Pronase) lageropløsning til hentning af antigen
- Proteaseen opløses i 200 mL PBS.
- Forberedelse af skyllebufferen PBS-T
- Tilføj 10 mL mellem 80 og 990 mL PBS. Bland det godt for at danne en homogen opløsning.
4. Deparaffinisering og vævsrehydrering
- Lav 5 μm paraffin sektion ved hjælp af en mikrotom, flyde det på et vandbad ved 38 °C og indsamle på glas dias. Mærk diasene med en reagensresistent pen/markør.
- Sæt rutsjebanerne på en bakke og smelt i en 55-60 °C ovn i 1 time. Opgrader ikke temperaturen over 60 °C, da den kan ødelægge det virale antigen.
- Fjern dias fra ovnen og straks deparaffinize i 3 på hinanden følgende xylen skylninger på 5 min hver i opvasken 1, 2 og 3.
- Rehydrere sektionerne på diaset ved sekventiel nedsænkning i faldende fortynding af ethanol til deioniseret vand: (4 til 11 er en dip rinse) skål 4: xylen/100% ethanol (1:1); fad 5: 100% ethanol; fad 6: 100% ethanol; fad 7: 95% ethanol; fad 8: 95% ethanol; fad 9: 80% ethanol; fad 10: 70% ethanol; fad 11: deioniseret vand (Figur 1. Parabol set-up).
FORSIGTIG: Xylen er et farligt kemikalie, og arbejdet skal udføres i en røghætte.
5. Proteolytisk antigenudtagning
- Behandl dias med protease (2,5 μg/mL PBS) i 30 min for proteolytisk antigenudtagning i fad 12.
- Skyl derefter i PBS-T i 10 min (fad 13).
- Behandl med 3% hydrogenperoxid i 10 min (fad 14).
- Vask igen med PBS-T i 10 min (fad 15).
6. Farvningsprocedure
- Håndter dias en ad gangen, så de resterende dias er nedsænket i bufferen (fjern ikke hele diasholderen - hold dias våde). Fjern en slide og blot off overskydende buffer (ved hjælp af et køkkenrulle) fra omkring vævssektionen er omhyggelig med ikke at forstyrre vævssektionen. Inkuber dias i et fugtighedskammer, lavet ved at placere fugtede papirhåndklæder, på laboratoriebænken top14 ved stuetemperatur med normalt gedeserum (blokering) i 15 minutter.
- Inkuberes med det optimale forudbestemte fortyndings primære anti-rabies antistof (1:250 fortynding af musefjendtligt rabiesserum, ikke-offentliggjort) (positiv kontrol) og negative kontrolantistoffer ved stuetemperatur samme som ovenfor (trin 6.1.) i 60 min uden vasker imellem.
- Efter 60 min, vask med PBS-T i 10 min (fad 16).
- Inkuberes med det biotylerede antistof (artspecifikt) i et fugtighedskammer ved stuetemperatur i 15 min (håndtering samme som trin 6.1.).
- Vask med PBS-T i 10 min (fad 16).
- Inkuberes med Streptavidin-HRP-kompleks i et fugtighedskammer ved stuetemperatur i 15 min (håndtering samme som 6.1.).
- Vask med PBS-T i 10 min (fad 16).
- Inkuber med peroxidasesubstrat, amino-ethylcarbazol (AEC), i et fugtighedskammer ved stuetemperatur i 10 min. Lav AEC lige før brug. For at gøre dette skal du tilføje 1 ML AEC-lageropløsning til 14 ml 0,1 M acetatbuffer, pH 5.2. Der tilsættes 0,15 mL på 3% H2O2. Blandingen filtreres lige før brug (0,45 μm filter).
BEMÆRK: Arbejdsløsningen af AEC er kun stabil i 2-3 timer. AEC-lageropløsningen kan opbevares i køleskabet i længere perioder. - Vask i deioniseret vand 10 min (fad 17)
- Counter farves med Gill's Hematoxylin fortyndet 1:2 med deioniseret vand i 2 min (fad 18).
- Skyl overskydende Hematoxylin af med deioniseret skylles af vanddyp (fad 19 og 20).
- Skyl i Scott's Tap water 30 s (bluing opløsning) fad 21.
- Vask i deioniseret vand 10 min (fad 22)
- Fjern dias en ad gangen - monter med vandopløseligt monteringsmedium.
- Læs dias på et let mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser repræsentative IHC farvningsresultater af positive og negative kontrolprøver i forskellige testede hjernevæv. Figur 2A,D,G repræsenterer positive prøver ved henholdsvis 200x, mens figur 2B,E,H svarer til henholdsvis 400x forstørrelse. Figur 2A-C svarer til hjernestammen; Figur 2D-F svarer til cellerne lillehjernen og Purkinje; og figur 2G-I svarer til hippocampus. Figur 2C, F, jeg er prøver af negativ kontrol. Den magentarød farvning demonstrerer farveudviklingen ved hjælp af AEC-substrat i den blå baggrund (Hematoxylin counterstain) på grund af reaktiviteten af antistoffer mod rabiesantigen. AEC er et peroxidasesubstrat, som ved oxidationsreaktion, katalyseret af HRP, resulterer i vandopløseligt bundfald, der kan observeres under et let mikroskop.
Et positivt resultat i IHC svarer til magenta rød farvning i vævssektioner. Farvning af cytoplasmaiske indeslutninger og granulære indeslutninger af varierende størrelse er tegn på prøver, der er positive for RABV-infektioner. Prøver anses for negative, hvis der ikke blev observeret nogen specifik rød farvning eller kun den blå baggrund på grund af hæmatoxylin. Ud over den positive farvning kan fordelingen af indeslutninger give indirekte kvantificering af niveauet af rabiesantigen i stikprøven, hvilket kan svare til virusbelastningen af vævsprøverne. Uanset distributionsniveauerne vil enhver specifik farvning klassificere prøven som positiv for RABV-antigendetektering.
Figur 1: Rutediagram, der angiver forskellige trin til IHC-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Immunohistokemisk farvning af positivt og negativt rabieshjernevæv. (A) Intracytoplasmaiske virusudlemmelser og påvisning af rabiesvirusantigen i hjernestammen 200x total forstørrelse; (B) positiv hjernestamme 400x; (C) hjernestamme negativ kontrol 200x; d) indeslutninger af rabiesvirus inden for lillehjernen 200x (E) cerebellum og Purkinje celler 400x; (F) cerebellum negativ kontrol; (G) Virale indeslutninger i hippocampus 200x; (H) hippocampus 400x; hippocampus negativ kontrol 200x. Den røde plet angiver tilstedeværelsen af rabiesvirusantigen ved hjælp af Streptavidin-biotin-kompleks farvningsmetode (AEC-substrat). Hematoxylin counterstain (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af den høje dødelighed af rabies efter symptomdebut er diagnosen af mistænkte dyr for RABV-infektion yderst kritisk for en passende profylaktisk behandling efter eksponering. Rabiesdiagnose afhænger primært af DFA, DRIT og PCR-baserede teknikker ved hjælp af frisk eller frossen væv. Til test af formalinfast væv giver IHC-testen en alternativ metode til følsom og specifik påvisning af RABV-antigen. Mens væv fastgjort i formalin har proteiner stabiliseret på grund af modifikation af sidekæder som krydsbinding, prøverne skal behandles før antigendetektering. I denne protokol blev epitoperne genvundet gennem den delvise proteolytiske fordøjelse af protease (f.eks. Pronase) for at muliggøre binding af primære antistoffer til RNP-komplekset. Mens mAbs reaktiv mod N protein er overvejende påberåbes i DFA og DRIT, pAbs, der er reaktive mod flere epitoper på N protein ville være foretrukket til en IHC-test. Desuden kan reaktiviteten eller pAb'erne være bredere i forhold til forskellige RABV-varianter og mod ikke-rabies lyssavirus sammenlignet med mAbs.
En af de største begrænsninger ved IHC-testen er, at protokollen involverer flere sekventielle trin og tager ca. 6 timer til færdiggørelse. Hvis vævet skal fastgøres i formalin og indlejres i paraffinblokke, kræver det yderligere 1 - 2 dage, før vævet kan farves. En anden begrænsning er den manglende tilgængelighed af kommercielle primære anti-rabies antistoffer til IHC-testen. Men, IHC giver en mulighed for at udføre rabies diagnose, når kun FF væv er tilgængelige for test. IHC-testen er særlig vigtig til test af rabiestilfælde, hvis halvdelen af vævene opbevares i formalin (og andet ufikset væv testet af DFA), og det var nødvendigt at teste hele tværsnit af hjernestammen og andet væv, som det kræves til diagnose. Rabies antigen påvisning af IHC test kan anvendes til human post mortem hjerneprøver til diagnosticering og / eller retrospektiv analyse af mistænkelige tilfælde baseret på de kliniske symptomer. Mens IHC ikke blev godkendt som en primær eller bekræftende test for rabiesdiagnose, ligesom DFA, metoden registrerer antigen ved hjælp af rabies specifikke antistoffer. Sammenligning af DFA ved hjælp af fersk/frosset vs. FF-væv gav samme følsomhed og specificitet15. Medmindre antistoffer er direkte konjugeret til FITC (kravet til DFA test), HRP mærkede antistoffer kan anvendes i IHC til farvning rabies antigen. Fordelen ved HRP-baseret detektion er evnen til at bruge et let mikroskop til observationen. De nuværende kommercielt tilgængelige DFA-reagenser, FITC konjugerede rabiesspecifikke antistoffer (mAbs), registrerer ikke antigen efter formalinfiksering på grund af ændring af epitoper. Men hvis FITC konjugerede rabies specifikke pAbs er tilgængelige, kan det bruges som en farvningsmetode, som anbefalet af Verdenssundhedsorganisationen16. Ud over antigendetektering kan FF-væv udsættes for RNA-isolering efterfulgt af PCR og sekventering ved hjælp af specifikke primere til at bekræfte tilstedeværelsen af RABV-genomisk RNA.
De andre fordele ved formalin-faste væv omfatter bestemmelse af histologiske ændringer ved hæmatoxylin og eosin farvning metode. Mens formalinbehandlingen bevarer proteinet, inaktiverer den fuldstændigt de fleste patogener i prøven på grund af den omfattende krydsbinding af proteiner og nedbrydning eller modifikation af nukleinsyrer. Metoden forbedrer således sikkerheden ved biologisk prøvehåndtering, forsendelse og testning sammenlignet med DFA. Acetonefikseringstrinnet i DFA inaktiverer ikke RABV og skal håndteres med passende PPE17. Prøverne efter formalin fiksering er stabile og kan opbevares ved omgivelsestemperatur, som er velegnet til lavressourceområder, hvor adgangen til en køleopbevaring er begrænset. Tilsvarende kan paraffin-indlejret formalin-fast væv overvejes til langtidsopbevaring ved omgivelsestemperaturer uden at miste antistofreaktiviteten mod proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker de laboralister, epidemiologer og datterselskaber med folkesundhed afdelinger for prøve indlæg til Centers for Disease Control og Forebyggelse. Resultaterne og konklusionerne i denne rapport er forfatternes og repræsenterer ikke nødvendigvis den officielle holdning hos Centers for Disease Control and Prevention. Brug af handelsnavne og kommercielle kilder er kun til identifikation og indebærer ikke godkendelse af Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
