Summary
İskelet kasının kardiyotoksin aracılı yaralanması ve kendi kendine teslim edilen siRNA enjeksiyonunun bir kombinasyonunu kullanarak uydu hücrelerinde belirli bir genin fonksiyonel kaybını araştırmak için in vivo yöntemini tanımlıyoruz.
Abstract
İskelet kası yaralanmadan sonra kendini yenilemek için muazzam bir kapasiteye sahiptir. Bu süreç esas olarak kas kök hücreleri tarafından tahrik edilir, ayrıca uydu hücreleri denir. Uydu hücreleri transkripsiyon faktörü Pax7 ifadesi ve istirahat iskelet kası bazal lamina altında konumları ile karakterizedir. Yaralanma üzerine, uydu hücreleri aktive olsun, ya yeni miyofiberler oluşturmak ya da hasarlı olanlar ile kaynaşmak için kendi kendine yenileme veya farklılaşma geçmesi. In vivo uydu hücrelerinin işlevselliği iskelet kasının kardiyotoksin bazlı yaralanma modeli kullanılarak araştırılabilir. İskelet kasının yenilenmesi sırasında bir genin işlevini incelemek için çoğunlukla transgenik fare modelleri kullanılmaktadır. Burada transgenik farelere alternatif bir yöntem salıyoruz, rejenerasyon sırasında uydu hücrelerindeki gen fonksiyonlarını araştırmak için, örneğin transgenik farelerin mevcut olmadığı durumlarda. Belirli bir iskelet kasının kardiyotoksin aracılı yaralanmasını, diğer hücreler arasında uydu hücreleri tarafından alınan rejenerasyon kaslarına kendi kendine sağlayan bir siRNA enjeksiyonu ile birleştiriyoruz. Bu nedenle, transgenik farelere gerek kalmadan fizyolojik koşullar altında rejenerasyon sırasında uydu hücrelerindeki gen fonksiyonlarını analiz etmek için bir yöntem salıyoruz.
Introduction
İskelet kası, toplam vücut ağırlığının yaklaşık %40'ını temsil eden ve gönüllü hareket sağlayan vücudun en büyük dokusudur. İskelet kasıdoku mimarisi esas olarak postmitotik oluşur, ölümcül farklılaşmış, multinükleozlu miyofenler yanı sıra periferik sinir sistemi çeşitli diğer hücreler, vasküler sistem, ve interstisyel hücreler1. Daha da önemlisi, iskelet kası yenilemek ve yaralanma veya hasar üzerine fonksiyon geri büyük bir kapasiteye sahiptir2. Bu süreç doku yerleşik kas kök hücreleri de uydu hücreleri3,4denir bağlıdır. Uydu hücreleri miyofiber ve bazal lamina arasında yer alır ve transkripsiyon faktörü Pax75,6,7ifadesi ile karakterizedir. Homeostatik koşullar altında, uydu hücreleri quiescent ama travmatik yaralanma nedeniyle aktive olsun, örneğin, eksantrik egzersiz yoluyla veya deneysel yılan zehri kardiyotoksin enjeksiyonu yoluyla6,8. Aktive edildikten sonra, Pax7 pozitif uydu hücreleri myod ve Myf5'i birlikte ifade eder, bu da kök hücreleri miyojenik farklılaşmaya adatır. Bağlılık faktörlerinin düzenlenmesine direnen uydu hücreleri, köklük potansiyellerini koruyacak ve kök hücre havuzunu gelecekteki talepler için doldurmak için bu niskene geri dönecektir. Miyojenik ata havuzunun genişlemesinden sonra transkripsiyonel ağlar, hücre döngüsü çıkışı ve terminal farklılaşmasını başlatmak için Miyojenin gibi farklılaşma faktörleri tarafından aktive edilir. Bu miyoprogenitorlar daha sonra birbirlerine veya miyonükleer etki alanının boyutunu korumak için miyoküleklei katkıda bulunan mevcut miyofiberler için sigorta. Miyofiberler Miyozin Ağır Zincir gibi terminal kas farklılaşma genlerini ifade eder. Son olarak, yeni oluşan miyofiberler büyümek ve iskelet kası fonksiyonel birimleri oluşturmak için olgun9,10.
İskelet kasının yenilenmesi kas hastalıkları veya yaşlanma dahil olmak üzere çeşitli koşullardan etkilenebilir11,12, hafif bozukluklar dan hayatı tehdit eden koşullara kadar, örneğin, Duchenne kas distrofisi13 , 14. Bu nedenle, rejeneratif tıp uydu hücre fonksiyonu 15 ,16hedefleyerek doğalrejeneratif güç kullanarak hasarlı veya arızalı iskelet kas dokusu geri amaçlamaktadır. İskelet kasının yenilenmesi sırasında endojen niş uydu hücrelerinin tam potansiyelini kullanmak için gereklidir. Deneysel yaklaşımlar miyofiberler17bitişik uydu hücrelerini izole etmek için mevcut olsa da, kendi çevresi ile uydu hücrelerinin hücresel ve sistemik etkileşimleri tam karmaşıklığı sadece in vivo recapitulated olabilir. Bu bağlamda, iskelet kas rejenerasyonu hakkında büyük bilgi fare yaralanma modelleri kullanılarak elde edilmiştir2,18.
Burada in vivo tibialis anterior kas kardiyotoksin kaynaklı hasar kök hücre aracılı rejenerasyon çalışması için özel bir deneysel fare yaralanma modeli tanıtmak. Kardiyotoksin, miyofik depolarizasyon ve nekroz neden olan bir yılan kaynaklı sitolitik toksin, tibialis ön kas içine enjekte edilir, hangi sırayla doku dejenerasyonu tetikler yenilenme. Akut rejenerasyon sırasında genlerin işlevini analiz etmek için, kendi kendine teslim siRNA'lar yaralanmadan sonra 3. Deneysel hayvanlar çeşitli zaman noktalarında kurban edilir ve tibialis ön kasları toplanır. Diseksiyon kasları dondurulmuş ve daha fazla kriyo-kesit için işlenir. İmmünofloresan mikroskopisi daha sonra rejenerasyon belirteçlerini analiz etmek için kullanılır. Bu yöntem, yabani tip fareler kullanarak iskelet kasının uydu hücresi tahrikli rejenerasyon sırasında tek bir genin işlevinin araştırılması için izin verir.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz Hayvan Refahı Bölümü tarafından onaylandı (03-048/16; TLV; Kötü Langensalza, Almanya).
1. Kardiyotoksin kaynaklı Kas Yaralanması
NOT: Ulusal Hayvan Refahı Yasası uyarınca ve uygun aseptik koşullar altında yaşayan fareler içeren tüm deneyleri gerçekleştirin. Ayrıca, hayvanların kurban edilmesi ulusal Hayvan Refahı Yasası uyarınca yapılmalıdır.
- İnhalasyon anestezisi için kullanılan inhalasyon kutusunu ve ameliyat alanını %70 etanol ile dezenfekte edin. Ameliyatın yapılacağı ısıtma yastığına steril bir cerrahi bez yerleştirin.
- Isıtma yastığını 37 °C'de açın.
- Ameliyatbaşlamadan 15 dakika önce analjezik (örn. 1 mg/kg vücut ağırlığı meloksikam subkutan) uygulayın.
NOT: Tipik bir deney için, en az 6 haftalık, cinsiyetuyumlu ve iyi bir genel fiziksel durumda fareler kullanın. - Kardiyotoksin çözeltisini (% 0,9 NaCl'de 20 μM) hazırlayın, çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
- Kardiyotoksin çözeltisinin oda sıcaklığına (RT) ulaşmasını bekleyin.
- Fareyi inhalasyon kutusuna aktarın ve isofluran (saf oksijende %3,5 - %5) anestezi yitirin. Bir parmak sıkışmayanıt eksikliği ile anestezi derinliğini kontrol edin.
- Fareyi temiz bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin ve burun maskesi ile anesteziyi koruyun (saf oksijende %1,5 - %3 izofluran). Kranial alt bacağın enjeksiyon alanını tıraş edin (dizden patiye, Şekil 1A). Tüm aşırı gevşek saç kaldırın.
NOT: Odadaki tıraş ve enjeksiyon alanının fiziksel olarak ayrılması enjeksiyonlar için daha steril koşullar sağlayacaktır. - Fareyi steril bir cerrahi bezle kaplı ısıtma yastığının üzerine yanal recumbent pozisyonunda yerleştirin ve burun maskesi ile anesteziyi koruyun (saf oksijende %1,5 – %3 izofluran).
- % 70 etanol ile kranial alt bacak enjeksiyon alanı dezenfekte (diz pençe).
- Yeterli bir anestezi derinliği sağlamak için kas içi enjeksiyona başlamadan önce bir parmak ucutu yapın.
- 29 kalibrelik bir iğne ile bir insülin şırınga kullanarak tibialis ön kas içine 50 μL kardiyotoksin (20 μM% 0.9 NaCl) enjekte. İlk olarak, sadece diz distal deri delin.
- İğneyi kas içine tam olarak yerleştirin (miyofiber oryantasyonda/tibia kemiğine paralel olarak) ve kardiyotoksinin kasın tam uzunluğu boyunca yavaşça (10-20 s) enjekte edin ve böylece kardiyotoksinin eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için iğneyi ileri geri hareket ettirin. tüm tibialis anterior kas yaralanması (Şekil 1B,C).
NOT: Sadece bir bacaktan tibialis anterior kas yaralanması, kontralateral tibialis anterior kas iskelet kasları patolojik kardiyotoksin yaralanması önce etkilenmemiş olduğunu belirlemek için bir iç kontrol olarak hizmet verebilir. - Fareyi ısıtma yastığına yerleştirilen kafesine geri aktarın ve hayvan bilinçli olana ve ambulatuar olana kadar iyileşme sürecini izleyin.
NOT: Fareler sadece hafif bir topallık gösterir. Fareler ağır topallama ve hiç bacak üzerinde ağırlık koymak yoksa, fare kurban. - Analjezikleri takip eden 2 gün boyunca uygulayın (örn. 1 mg/kg vücut ağırlığı meloksikam subkutan olarak, her 24 saatte bir) ve haftalık olarak takip edin.
2. Rejeneratif Tibialis Anterior Muscle içine Kendi Kendine teslim siRNA Enjeksiyonu (Gün 3 Post Kardiyotoksin Yaralanması)
- SiRNA çözeltisini (örn. siRNA akıllı havuz) üreticinin talimatına göre %0,9 NaCl (2 μg/μL nihai konsantrasyonu) olarak yeniden sulayarak hazırlayın.
NOT: SiRNA, hücrelerin pasif alımını kolaylaştırmak ve nükleaz bozulmasından korumak için kimyasal olarak modifiye edilmiştir. Transfeksiyon reaktifleri gerekli değildir, böylece toksisite azalır. Aynı geni hedefleyen dört bağımsız siRNA dizisinden oluşan akıllı bir havuz kullanmak nakavt verimliliğini artırır. - SiRNA'yı -20 °C'de saklayın ve buz üzerinde ameliyathaneye aktarın.
- İnhalasyon anestezisi için kullanılan inhalasyon kutusunu ve ameliyat alanını %70 etanol ile dezenfekte edin. Ameliyatın yapılacağı ısıtma yastığına steril bir cerrahi bez yerleştirin.
- Isıtma yastığını 37 °C'de açın.
- Fareyi inhalasyon kutusuna aktarın ve isofluran (saf oksijende %3,5 – %5 oranında inisiyasyon) ile anestezi ye tirin. Bir parmak sıkışmayanıt eksikliği ile anestezi derinliğini kontrol edin.
- Fareyi steril bir cerrahi bezle kaplı ısıtma yastığının üzerine yanal recumbent pozisyonunda yerleştirin ve burun maskesi ile anesteziyi koruyun (saf oksijende %1,5 – %3 izofluran).
- Kafatası alt bacak enjeksiyon alanı dezenfekte (diz pençe).
- Yeterli bir anestezi derinliği sağlamak için kas içi enjeksiyona başlamadan önce bir parmak ucutu yapın.
- 29 G iğneli bir insülin şırıngası kullanarak yaralı tibialis ön kaslarına 50°L siRNA çözeltisi enjekte edin (%0,9 NaCl'de 100 μg'ye kadar toplam; hedef genin ekibe doğru; şifreli siRNA'yı kontrol olarak kullanın). İlk olarak, sadece diz distal deri delmek, sonra tibialis ön kas içine iğne takın.
- İğneyi kas içine tam olarak yerleştirin (miyofiber yönü/tibia kemiğine paralel olarak) ve siRNA çözeltisini kas boyunca yavaşça (10 – 20 s) enjekte edin ve iğneyi ileri geri hareket ettirerek siRNA'nın eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlar. tüm tibialis ön kas.
- Fareyi ısıtma yastığına yerleştirilen kafesine geri aktarın ve hayvan bilinçli olana ve ambulatuar olana kadar iyileşme sürecini izleyin.
NOT: Analjezi mutlaka siRNA enjeksiyonu aşağıdaki değildir.
3. Tibialis Anterior Kas Diseksiyon
- Hava kabarcıklarını önlemek için kullanmadan önce donma çözeltisini (2 parça OCT bileşiği ve deiyonize suda %30 sakaroz) en az 12 saat hazırlayın.
- Bir kalem etrafında bir alüminyum folyo sararak dondurucu kalıpları hazırlayın ve bant ile mühür. Kalıbın alt kısmı çift, kapalı bir yüzey sağlar.
NOT: Daha küçük dondurucu kalıplar, kasların donma eserlerinden kaçınarak daha hızlı donmasını sağlar. - Fareyi, örneğin, CO2 soluma ile, rejenerasyon un ilgili zaman noktasında kurban edin ve tüm fare ve diseksiyon araçlarını %70 etanol ile püskürtün.
NOT: Servikal çıkığı uygulanabilir, ek olarak, tibialis ön kası izole ederken bacakta aşırı kanamayı önlemek için. - Ekstra ince keskin makas (kesme kenarı: 13 mm) ile ayak bileğinde deri keserek ve forceps kullanarak diz doğru deri çekerek yaralı arka bacak kürk ve deri çıkarın.
- Ayak bileğinde tibialis ön tendon ortaya çıkarmak için, ayak doğru kalan deri çekin veya keskin makas ile kesilmiş.
NOT: Fare, daha iyi sabitleme sağlamak için bir destek panosuna sabitlenebilir. - tibialis ön kas hasat önce, ince forceps kullanarak fasya kaldırmak (Dumont 5 veya 7, düz veya kavisli). Kapalı çömlekleri, yaralı bacağın ayak bileğindeki tibia kemiğinin yanındaki fasyadan geçirin(Şekil 2A). Böylece fasya yırtılma ve tibialis ön kas açığa diz doğru forceps taşıyın (Şekil 2B).
- Tibialis anterior kas izole etmek için, distal tendon maruz ve ince forceps ile kapmak (Dumont 7, kavisli). Yay makas (kesme kenarı: 5 mm, uç çapı: 0,35 mm) kullanarak tendon kesin ve kas çekin (tendon tutarak) diz doğru.
- Tibialis ön kas hasat için, keskin makas kullanarak mümkün olduğunca diz yakın kesti.
- Donmadan önce, orta göbek bölgesinin analizini sağlamak için, kasın orta karın bölgesindeki tibialis ön kasını düz makasile eşit büyüklükte iki yarıya kesin(Şekil 2C,D).
- Donma kalıbını donma çözeltisi ile yarıya kadar doldurun.
- Tibialis ön kasının iki yarısının donma kalıbına yerleştirin ve orta göbek bölgesi kalıbın dibine bakacak şekilde(Şekil 2E). Tibialis anterior yarıları kas devrilme önlemek için dondurucu kalıp duvara yaslanmış dik bir pozisyonda takılı olduğundan emin olun.
NOT: Daha dondurucu çözelti kalıp içinde, daha uzun donma alacak, böylece kriyo-eserler riskini artırarak. - Dondurucu kalıbı forceps kullanarak tutun ve sıvı nitrojene yarıya aktarın(Şekil 2F). Dondurma işlemi sırasında dondurucu kalıba sıvı nitrojen girmediğinden emin olun.
- Dondurma işlemini gözlemleyin, donma ortamı saydamdan beyaza renk değiştirir ve katılaşır. Dondurucu kalıbı sıvı nitrojene birkaç saniye batırın ve dondurucu kalıbı -80 °C'lik bir dondurucuya veya ileride işlenmesi için buz kuruna aktarın.
- Dondurulmuş kasları donma kalıplarında -80 °C'de daha fazla kullanıma kadar saklayın.
NOT: Dondurma kalıpları, etiketleme ve düzenli depolamaya olanak sağlayan 24 kuyulu plakalara veya 1,5 mL reaksiyon tüpüne iyi uyum sağlar. - Kuru buz üzerinde her zaman daha fazla kullanım için dondurucu kalıplarda kas kolu.
4. Rejenerasyon Tibialis Anterior Kas Kriyoseksiyon
- Kesitlenmeye başlamadan önce, kriyostat oda sıcaklığını -21 °C'ye, nesne sıcaklığını -20 °C'ye ve kesme kalınlığını 10, 12 veya 14 m'ye (gelecekteki uygulamalara bağlı olarak) ayarlayın (Şekil 3A).
- Dondurucu kalıptaki kas örneğini kriyostat'a aktarın ve birkaç dakika lığına sıcaklığa göre ayarlanın. Bu süre zarfında, mikroskop slaytlarını etiketle.
- Kriyostat içinde önceden soğutulmuş forceps kullanarak gömülü kas etrafında folyo çıkarın. Kriyomedium kolayca çözülmeye başladığında numuneye dokunmaktan kaçının.
- Katibialis ön kasının orta göbek bölgesi ile örnek monte kriyomedium kullanarak kriyostat metal örnek tutucu üzerine yukarı doğru yönlendirilir. Bu kas kesme sitesi (kalıp alt) deneyci karşı karşıya olmasını sağlar.
- Numune tutucuyu montajlı numuneyle birlikte kesit mekanizmasına takın.
NOT: Numunenin düzgün bir şekilde kesilmesini sağlamak için başlamadan önce yeni bir bıçak kullanın. - İlk olarak, örnek bloğu (30 μm) çift bir kesit düzlemi elde etmek ve kasın ilgili bölgesine ulaşmak için kırpın(Şekil 3B).
- Budamadan sonra, ilgili kalınlıktaki ardışık kesitleri (örn. 14 μm).
- Mikroskop cam slaytlar üzerinde slayt yüz aşağı bölüm üzerinde tutarak bölümleri toplayın. Bölüm slayta iliştirilir (Şekil 3C).
- İmmünfloresan veya immünohistokimya için daha fazla veya doğrudan kullanılana kadar -80 °C veya -20 °C'de bölümleri saklayın.
5. Rejenerasyon Belirteçleri için İmmünoboyama
- Nemli bir odada diğer tüm adımları gerçekleştirin.
- Kısaca, oda sıcaklığında bölümleri dengeleyin.
- RT'de 5 dakika boyunca slayt başına %2 PFA (PBS, pH 7,4)'ın 1 mL'si olan bölümleri düzeltin.
- %2'lik PFA çözeltisini ilgili atık kabına dökerek çıkarın.
- RT'de 5 dakika boyunca 1 mL PBS (pH 7.4) ile 3 kez yıkayın.
- PBS'yi bir atık kabına dökerek çıkarın.
- Slayt başına, 10 dakika boyunca permeabilizasyon çözeltisinin 1 mL'sini (0,1 % Triton X-100, PBS pH'da 0,1 M Glisin 7,4) ekleyin.
- Permeabilizasyon çözeltisini bir atık kabına dökerek çıkarın.
- Kaydırma başına 150 μL bloklama çözeltisi (PBS pH 7.4'te M.O.M. 1:40) ekleyin ve kapak lı kapağı kapatın. RT'de 1 saat kuluçka.
- Kapak kaymasını ve engelleme çözeltisini çıkarın, slayt başına 100 μL birincil antikor solüsyonu uygulayın [PAX7, DSHB, fare IgG1, seyreltilmemiş veya devMHC, DSHB, seyreltilmemiş, fare IgG1ve laminin (tavşan, 1:1,000)] Kapak slip ile kaplayın. 4 °C'de Kuluçka O/N (geceleme).
NOT: Birincil antikorları atlayarak bir kontrol boyama gerçekleştirin, bunun yerine engelleme çözeltisi ile bölümü kuluçkaya yatırın. - RT'de 5 dakika boyunca 1 mL PBS (pH 7.4) ile 3 kez yıkayın.
- Bir atık kabına dökerek PBS çıkarın.
- İkincil antikor çözeltisi (Alexa Fluor 546 keçi anti-fare IgG1 ve Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG engelleme çözeltisi, 1: 1.000) slayt başına ekleyin ve kapak ile kapağı. RT'de 1 saat kuluçka.
- Karanlıkta slaytlar kuluçka, örneğin, kapsayacak veya siyah nemlendirilmiş oda kullanmak için bir alüminyum folyo kullanın.
NOT: Şu andan itibaren bazı ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, tüm adımlar daha az ışık koşullarında yapılmalıdır. - Kapak kaymasını ve ikincil antikor solüsyonu çıkarın.
- RT'de 5 dakika boyunca 1 mL PBS (pH 7.4) ile 3 kez yıkayın.
- PBS'yi bir atık kabına dökerek çıkarın.
- RT'de 5 dakika boyunca 10 μg/mL'lik son konsantrasyona slayt başına 1 mL çözelti ekleyerek DAPI boyama gerçekleştirin.
- DAPI boyama çözeltisini bir atık kabına dökerek çıkarın.
- RT'de 5 dk için 1 mL PBS (pH 7.4) ile 3 kez yıkayın.
- Yıkamada kullanılan PBS'yi tamamen çıkarın.
- 2 - 3 damla sulu montaj ortamı uygulayın ve doğrudan yeni bir kapak kayma ile slayt kapağı.
- Karanlıkta RT'de slaytları 1 saat kurutun.
- Lekeli bölümleri 4 °C'de karanlıkta floresan mikroskobu kullanarak daha fazla analiz edin.
6. Hematoksilin ve Eozin Boyama
- Nemli bir odada diğer tüm adımları gerçekleştirin.
- RT'de 5 dakika boyunca slayt başına %2 PFA (PBS, pH 7,4)'ın 1 mL'si olan bölümleri düzeltin.
- %2'lik PFA çözeltisini ilgili atık kabına dökerek çıkarın.
- Slaytları Coplin kavanozuna aktarın.
- Slaytları musluk suyuyla hafifçe durulayın.
NOT: Bölümlere zarar verebilecek kadar yüksek musluk açmayın. - Slaytları nemli odaya aktarın. Sıvıyı çıkarın.
- 2 dakika boyunca 1 mL Hematoksilin boyama solüsyonu (Solungaç No 3) uygulayın.
- Slaytları Coplin kavanozuna aktarın.
- Çekirdekler maviye dönene kadar kaydıraları musluk suyuyla hafifçe durulayın.
NOT: Bu sizin bölümlerizarar verebilir beri musluk çok yüksek açmayın. - Slaytları nemli odaya aktarın. Sıvıyı çıkarın.
- 1 mL Eosin Y çözeltisi uygulayın ve 2 dk kuluçkaya yatırın.
- Slaytları Coplin kavanozuna aktarın.
- Kaydıraklardan çıkan musluk suyu temiz olana kadar kaydıraları musluk suyuyla hafifçe durulayın.
- Tüm sıvı çıkarın ve 2 dakika boyunca slaytlar kuru bırakın.
- İmmünohistokimyaya uygun montaj ortamına monte edin.
Representative Results
Kardiyotoksinaracılı yaralanma öncesi ve sonrası tibialis anterior kasının hematoksilin ve eozin (H&E) boyanması tipik bir sonucu Şekil 4A,B'deverilmiştir. Kontrol kaslarında, kas mimarisi miyoliflerin çevresinde çekirdeklerin lokalizasyonu ve interstisyel alanda mononükleli hücrelerin birikmemesi ile görüldüğü gibi sağlamdır(Şekil 4A). Kardiyotoksin aracılı yaralanmadan 7 gün sonra merkezi konuma gelen çekirdeklerle işaretlenmiş yeni miyofifler oluşur (Şekil 4B). Ayrıca, mononükleli hücrelerin birikmesi görülebilir, çoğunlukla uydu hücreleri oluşan ama aynı zamanda bağışıklık hücreleri gibi non-miyojenik hücrelerden. Tüm kas tüm miyonüklei merkezi konumu ve tüm kas bölümünde mononükleli hücrelerin birikimi ile karakterize yaralı olmalıdır.
Rejenerasyon sürecinin ilerlemesini ve başarısını karakterize etmek için rejenerasyon belirteçleri kullanılarak birkaç immünütriküllü boyama yapılabilir. Uydu hücrelerinin sayısı, uydu hücreleri için kanonik belirteç olan Pax7'nin boyanması ile değerlendirilebilir (Şekil 4C,D). Yaralanmadan üç gün sonra uydu hücrelerinin sayısı artar(Şekil 4D),uydu hücreleri artık bazal lamina altında bulunmaz. Rejenerasyon sürecini daha fazla analiz etmek için, yeni oluşan miyolifler gelişimsel miyozine yönelik antikorlarla boyanabilir(Şekil 4E). Yeni oluşan miyofiberler merkezi olarak konumlanmış çekirdekleri ve gelişimsel miyozingüçlü bir ifade görüntüler. Miyofiberler olgunlaştıkça gelişimsel miyozin ekspresyonu azalır, nükleuslar miyofiberlerin çevresine göç ederken miyofenin çapı artar.
Tek bir genin rejenerasyon süreci üzerindeki etkisi transgenik fareler kullanılarak veya burada kendi kendine teslim eden bir siRNA enjeksiyonu ile gösterilebilir. Floresan etiketli kendi kendine teslim şifreli kontrol siRNA yaralanma dan sonra gün 3 rejeneratif tibialis ön kas içine enjekte edildi, uydu hücrelerinin çoğalması zirveleri zaman noktası. SiRNA uydu hücrelerinin enjeksiyonundan iki gün sonra floresan olarak etiketlenmiş siRNA 'nın varlığı analiz edildi (Şekil 4F). Floresan etiketli siRNA'yı rejeneratif kas içine enjeksiyondan iki gün sonra kaç uydu hücresinin aldığını analiz ettik(Şekil 5). Rejeneratif kastaki tüm uydu hücrelerinin yaklaşık %75'i floresan olarak etiketlenmiş siRNA için pozitifti. Ayrıca, tüm rejeneratif miyofenlerin yaklaşık %74'ünün floresan etiketli siRNA için pozitif olduğunu belirledik ve bu da rejeneratif miyofiberlerin %74'ünün siRNA'yı kapladığını ya da siRNA pozitif uydu hücrelerinin yeni miyofiberler oluşturmak için birbirleri veya zaten mevcut rejeneratif miyofiberler ile füzyon oluştu (Şekil 5). Bu, uydu hücrelerinin kendi kendine teslim eden siRNA'yı kapladığını ve siRNA'nın uydu hücrelerinde en az iki gün devam ettiğini göstermektedir.
Şekil 1: Tibialis ön kas içine kardiyotoksin enjeksiyonu. (A) Fareler isoflurane inhalasyonu ile anestezi edilir ve alt ekstremite tıraş edilir. (B) 29 G iğne tibialis anterior kas içine enjekte edilir(C) ve kardiyotoksin çözeltisi enjeksiyonu sırasında tibia kemik boyunca hareket ettirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yaralı tibialis anterior kasının diseksiyonu ve dondurulması ile ilgili adımlar. (A) arka ekstremite kasları maruz kalır(B) ve tibialis anterior kas çevreleyen fasya kas ortaya çıkarmak için yırtık. (C) Kas çıkardıktan sonra, keskin düz makas(D)kullanılarak benzer boyutta iki yarıya orta karın bölgesinde kesilir. (E) Parçalanmış kasın yarısı, donma çözeltisi ile doldurulmuş alüminyum folyo kalıbına gömülür ve sıvı nitrojen(F)içinde dondurulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tibialis anterior kasların kriyoseksiyonda yer alan ekipman ve adımlar. (A) Kriyostat'ın oda sıcaklığı -21 °C olarak ayarlanır. (B) Dondurma çözeltisindeki tibialis ön kası numune tutucuya monte edilir. (C) 14 μm kalınlığındaki kesitler cam mikroskop slaytlarına bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tibialis ön kasların yenilenmesinin temsili görüntüleri. Kavalkemiğin ön kaslarının h&E boyanması(A) ve kardiyotoksin yaralanmasından 7 gün sonra(B). (C) Yaralanmamış kas Pax7 pozitif (kırmızı) uydu hücreleri lamina ile işaretlenmiş bazal lamina altında yer alır (yeşil). Çekirdekler DAPI (mavi) ile sayaçları vardır. Pax7 pozitif hücreleri bir ok ile işaretlenir. (D) 10 günlük rejenerasyondan sonra miyolifler merkezi olarak konumlanmış çekirdeklerle karakterize edilir (mavi), Pax7 kırmızı, lamina yeşil olarak gösterilir. Pax7 pozitif hücreleri bir ok ile işaretlenir. (E) Yeni oluşan miyofiberler gelişimsel miyozin (kırmızı), lamina yeşil, çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıtlanır. (F) Floresan olarak etiketlenmiş kendinden teslim siRNA (siRED, kırmızı ile betimlenmiştir) hala uydu hücrelerinde bulunur (Pax7 pozitif, yeşil, inset bir ok ile işaretlenmiş) 2 gün kendi kendine teslim siRNA enjeksiyondan sonra rejenerasyon tibialis anterior kas (kardiyotoksin aracılı yaralanma dan sonra gün 3 enjeksiyon). Laminin beyaz olarak gösterilir, çekirdekleri DAPI (mavi) ile karşılekelenir. Ölçek çubuğu = 100 μm (A ve B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Floresan olarak etiketlenmiş siRNA alımının ölçülmesi. (A) Uydu hücreleri (Pax7 + hücreleri) tarafından siRNA alımının sayısallaştırılması ve iskelet kası rejenerasyon içine enjeksiyondan 2 gün sonra miyofiberler rejenerasyon. Kardiyotoksin aracılı yaralanma dan sonra enjeksiyon 3. n = 3, hata çubukları SEM.(B) (A) grafiğinde gösterilen grafiğin altında yatan nicelik gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada transgenik hayvanlara ihtiyaç duymadan iskelet kasının yenilenmesi sırasında belirli bir genin işlevini araştırmak için bir yöntem salıyoruz. Bu yaralanma dan sonra gün 3 rejenerasyon iskelet kası içine kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonu ile kardiyotoksin indüklenen kas yaralanması kombinasyonu ile gerçekleştirilir. Biz ayrıntılı kardiyotoksin ile kas yaralanması prosedürleri açıklanan, kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonu ve rejenerasyon ilerlemesini analiz etmek için hasat kasların işlenmesi. Yılan zehrinin iskelet kasına enjekte edilişini tüm kaslara etkili bir şekilde yaraladığını ve kendi kendine siRNA'ların diğer hücre tipleri arasındaki tüm uydu hücrelerinin yaklaşık %75'inde iskelet kasının yenilenmesi (Şekil 4, Şekil 5).
Özellikle dikkat tibialis anterior kasının homojen bir yaralanma üzerinde durulmalıdır yaralanma değişen derecelerde rejenerasyon sonucu etkisi ve bu yüzden de siRNA etkisi etkilenebilir beri. Ayrıca, tüm rejenerasyon alanı kendi kendine teslim siRNA enjekte edilmesi kritik öneme sahiptir. Rejenerasyon sürecinin analizi için, her zaman rejenerasyon iskelet kası benzer alanları karşılaştırmak için tavsiye edilir, bu nedenle, tibialis ön kası her zaman kas orta karın bölgesi karşılaştırmak için yarıya kesilmelidir. Kas analiz ederken, miyofiber bileşimi tibialis ön kas farklıdır ve bu nedenle farklı rejenere olabilir bu yana tüm kriyosection analiz edilmesi gerekir.
Uydu hücrelerinin işlevi bitişik izole tek miyofiberler kendi kültürü de dahil olmak üzere çeşitli deneysel prosedürler tarafından araştırılabilir17, transplantasyon ve indüklenen yaralanma sonrası iskelet kasırerererere analiz edilerek 18,19. İnvivo indüklenen yaralanma modeli, örneğin kardiyotoksin enjeksiyonu ile uydu hücrelerinin işlevini araştırmak, makrofajlar ve sistemik faktörlerin etkisinin araştırılması2. İskelet kası nın yaralanması çeşitli yollarla gerçekleştirilebilir, örneğin, eksantrik egzersiz, donma yaralanması, BaCl enjeksiyonu2 veya kardiyotoksin veya noteksi gibi yılan zehri enjeksiyonu18. Eksantrik egzersiz muhtemelen en fizyolojik yaralanma yöntemi iken, belirli bir kas yaralanması sadecesınırlıdır 20. Donma yaralanmaları, uydu hücrelerinin yaralanma bölgesine geçişi çalışmanın amacı olduğunda veya kasın sadece belirli bir kısmı yaralandığında uygulanabilir. Deneysel olarak donma yaralanmalarının dezavantajı, önceden soğutulmuş metal probu uygulamak için yapılması gereken açık cerrahidir. BaClenjeksiyonu 2 veya yılan zehirleri yaralanma en dramatik yöntemdir, bu nedenle en zorlu uydu hücresi fonksiyonu. Ayrıca, enjeksiyon minimal invaziv, cerrahi süresi, genel olarak, az beş dakika ve dikiş içermez, vb bu nedenle enfeksiyon riskini en aza indirmek.
Kas yaralanması çoğunlukla gen fonksiyonlarının kaybı fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için kullanılır, örneğin, Pax7 kaybı7,21. Özellikle yaşlı fareler bilimsel sorunun odak noktası ise, transgenik farelerin üretimi veya kullanımı genellikle mümkün değildir. Belirli bir geni hedefleyen kendi kendine teslim eden siRNA enjeksiyonu bu durumlarda uygulanabilir bir alternatiftir ve başarıyla kullanılmıştır22. Kısacası, farelerin tibialis anterior kası kardiyotoksin enjeksiyonu ile yaralandı ve fibronektin karşı yönlendirilen kendi kendine teslim siRNA'lar (FN) yaralanma dan sonra 3. Kaslar yaralanmadan 10 gün sonra incelendi ve siFN ile karıştırılmış siRNA kontrol koşullarında uydu hücre sayılarında önemli bir azalma gözlendi. SiRNA enjeksiyonundan 2 gün sonra tüm kas lysatlarında nakavt verimi kantitatif Real Time PCR ile belirlendi, ekspresyon düzeylerinde %58'lik bir azalma sağlandı ve doğum ve nakavt veriminin fonksiyonel için yeterli olduğu öne sürüldü. analizler22. Nakavt verimliliğini test etmek için alternatifler ya immünoblot ya da hedef gen karşı yönlendirilen antikorlar ile immünorfloresan analizleri vardır. In vivo enjeksiyonlar için kullanılan siRNA'nın etkinliği ve özgüllüğü, örneğin izole uydu hücrelerinde veya primer miyoblastlarda verimlilik test edilerek farelere enjekte edilmeden önce belirlenmelidir. Tek bir siRNA'ya karşı 4 farklı siRNA'dan oluşan akıllı bir havuzun kullanımı nakavt ın verimliliğini artırırken, aynı zamanda spesifik olmayan hedefleme riskini de artırır. Kullanılan tüm siRNA dizilerinin özgüllüğü, hedef dışı etkileri önlemek için hücre kültüründe test edilmelidir. Bir kontrol olarak, bir hedefolmayan şifreli siRNA tek başına bir siRNA enjeksiyonu enjeksiyon nedeniyle rejenerasyon sürecini etkileyebilir ve bu nedenle, kas ek hasar kullanılmalıdır. SiRNA enjekte zaman noktası bilimsel soruya ve hedef genin ifade profiline bağlıdır. Genellikle, kardiyotoksin yaralanması ndan sonra 3. Kardiyotoksin enjeksiyon hacmi oldukça yüksek olduğundan ve kas içine ek çözümler enjekte etmeden önce sıvı reabsorbsiyon yer almalıdır ilk siRNA enjeksiyonu için zaman noktası kardiyotoksin yaralanması ndan sonra en az 48 saat olmamalıdır. Genel olarak, siRNA'ların birden fazla enjeksiyonu veya farklı siRNA'ların bir kombinasyonu mümkündür, ancak yenileyici kas içine yapılan her enjeksiyonun ek hasara yol açtığını göz önünde bulundurmak gerekir.
Açıklanan yöntemin bir sınırlaması, gözlenen etkinin sadece uydu hücrelerindeki hedef genin yıkılmasına bağlı olmaması, bağışıklık hücreleri veya fibro-adipojenik progenitor hücreler gibi diğer hücre tiplerine atfedilmesi dir. Bu nedenle, bu deneyleri saf uydu hücrelerinin popülasyonunu araştıran deneylerle birleştirmek gerekir. Bir ya yüzen miyofiber kültürleri kullanarak deneyler yapabilir, uydu hücreleri komşu miyofiberler üzerinde kültürlü nerede ya da izole uydu hücreleri kullanarak transplantasyon deneyleri yapmak17.
Kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonuna alternatif olarak, bilimsel soruya bağlı olarak, yapIlebilen küçük molekül inhibitörleri veya rekombinant proteinlerin enjeksiyonudur. Örneğin, ekstrasellüler matriks protein fibronektin veya JAK / STAT sinyal küçük molekül inhibitörleri enjeksiyonu başarıyla yaşlı fareler de yapılmıştır15,16. İskelet kasının yenilenmesi sırasında belirli bir hücre tipinde belirli bir gen fonksiyonunun analizi, örneğin uydu hücrelerinde, indükleyici bir genetik fare modeli nin kullanılması yla mümkündür. Kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonları, rekombinant proteinler veya küçük molekül inhibitörleri iskelet kası rejenerasyon birden fazla hücre tipleri etkileyebilir.
Disclosures
Biz mükemmel teknik yardım ve Saskia Steiner siRNA transfection verimliliği belirlenmesi ile yardım için Christina Picker ve Christine Poser teşekkür etmek istiyorum. Biz büyük teknik destek için çekirdek hizmet histolojisi teşekkür ederiz, özellikle Sabine Landmann ve Linda Rothenburger. Biz de mükemmel destek için FLI hayvan tesisi fare teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) ve Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) tarafından J.v.M.'ye verilen bağışlarla desteklenmiştir.
Acknowledgments
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).
- Schworer, S., et al. Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals. Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Hall, M. N., et al. Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).
- Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury. Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
- Bentzinger, C. F., et al. Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion. Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).
