マイクロピペット吸引による電気形成による巨大ユニラメラハイブリッド小胞の閉塞と機械的性質の測定
Summary
プロトコルの目的は、マイクロピペット吸引によって巨大小胞の膜機械的特性を確実に測定することである。
Abstract
リン脂質と共重合体から得られる巨大小胞は、制御および標的薬物送達、診断のためのバイオセンサー内の生体分子認識、人工細胞の機能膜、バイオインスピレーションマイクロ/ナノ反応器の開発など、さまざまな用途で利用できます。これらのすべてのアプリケーションにおいて、膜特性の特徴付けは基本的に重要である。既存の特性評価技術の中でも、E.Evansによって開拓されたマイクロピペット吸引は、領域圧縮率率、曲げ弾性率および溶解応力および歪みなどの膜の機械的特性の測定を可能にする。ここでは、脂質または共重合体(またはその両方)の薄膜から巨大小胞を得るためのすべての方法論と詳細な手順、マイクロピペットの製造および表面処理、および前述したすべてのパラメータの測定につながる吸引手順を提示する。
Introduction
リン脂質から得られる巨大小胞(リポソーム)は、1970年代から塩基性細胞膜モデル1として広く用いられている。1990年代後半には、共重合体の自己集合から得られた小胞形態は、脂質類似体2、3を参照してポリマーソームと命名され、機械的安定性が弱く、モジュラー化学機能が悪いリポソームに代わる興味深い代替手段として急速に登場した。しかし、後者は細胞膜の主成分であるリン脂質から構成されているため、細胞バイオミメティックキャラクターはリポソームに比べてかなり限定的である。さらに、膜透過性が低い場合は、膜を介した種の拡散を制御する薬物送達のような一部の用途で問題となる可能性があります。近年、ハイブリッドポリマー脂質小胞および膜を設計するブロック共重合体とリン脂質の会合は、研究の数が増加している4、5である。主なアイデアは、各成分の利点(脂質二重層の生体機能性と透過性とポリマー膜の機械的安定性および化学的多様性)を相乗的に組み合わせたエンティティを設計することです。
今日、異なる科学コミュニティ(生化学者、化学者、生物物理学者、物理化学者、生物学者)は、より高度な細胞膜モデルの開発に対する関心が高まっています。ここで、我々の目標は、可能な限り詳細に、既存の方法論(電気形成、マイクロピペット吸引)を提示し、ハイブリッドポリマー脂質巨大小胞である最近の「高度な」細胞膜モデルと巨大小胞の機械的特性を得て特徴付ける。
これらの方法の目的は、膜の領域圧縮性および曲げモジュライならびに溶解応力およびひずみの信頼性の高い測定を得るすることである。巨大小胞の曲げ剛性を測定するために存在する最も一般的な技術の1つは、直接ビデオ顕微鏡観察に基づく変動分析6、7です。しかし、これは大きな目に見える膜の変動を必要とし、厚い膜(例えばポリマーソーム)上で体系的に得られません。エリア圧縮率係数は、ラングミュア・ブロジェット技術を使用して実験的に決定できますが、ほとんどの場合、単層8上で。マイクロピペット吸引技術は1つの実験の二重層形成巨大な二重小胞小胞(GUV)の両方のモジュライの測定を可能にする。
以下の方法は、二重層を形成できるすべての両親媒性分子または高分子に対して適切であり、その結果、電気形成によって小胞が生じる。これは、電気形成の温度で二重層の流体特性を必要とします。
Protocol
1. マイクロピペットの製造 注:ここでは、内径が6~12μmのマイクロピペットと、約3~4mmのテーパ長が必要です。マイクロピペットの製造方法の詳細な方法を以下に説明する。 ホウケイ酸ガラスキャピラリーをプーラーのドローバーに入れ、ノブを締めて両端を固定します。 ヒーター室の側面の穴からガラスを慎重にスライドさせます。 もう一方の端?…
Representative Results
前述のプロトコルでは、 我々は、異なる合成巨大ユニラメラ小胞(GUV)を研究し、リン脂質から得られる:2-オレオロイル-1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、三重黒分子:ポリ(エチレキシド)-b-ポリ(ジメチルシロキサン)-b-ポリ(エチレオキシド)(PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)以前の研究で合成された13、…
Discussion
マイクロピペットのコーティングは信頼できる測定を得るための重要なポイントの1つである。小胞のマイクロピペットへの付着を防止する必要があり、コーティングは、BSA、β-カゼインまたはサーファシルを用いて文献17、18、19、20、21で一般的に使用される。塗布手順…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、ANRの財政支援(ANR Sysa)を感謝して認めた。
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
Referências
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Citar este artigo
Ibarboure, E., Fauquignon, M., Le Meins, J. Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration. J. Vis. Exp. (155), e60199, doi:10.3791/60199 (2020).