Обслушание гигантских unilamellar гибридных пузырьков электроформации и измерения их механических свойств Micropipette аспирации
Summary
Цельпротокола состоит в том, чтобы надежно измерить мембранные механические свойства гигантских пузырьков с помощью микропипетики аспирации.
Abstract
Гигантские пузырьки, полученные из фосфолипидов и кополимеров, могут быть использованы в различных областях применения: контролируемая и целенаправленная доставка лекарств, биомолекулярное распознавание в биосенсорах для диагностики, функциональные мембраны для искусственных клеток и разработка биовдохновленных микро/нанореакторов. Во всех этих приложениях характеристика их мембранных свойств имеет основополагающее значение. Среди существующих методов характеристик, микропайпет аспирации, впервые E. Эванс, позволяет измерения механических свойств мембраны, такие как модуля сжатия области, изгиб модуля и лизис напряжения и деформации. Здесь мы представляем все методологии и подробные процедуры получения гигантских пузырьков из тонкой пленки липидов или copolymer (или обоих), производство и поверхностная обработка микропипететов, а также процедуру аспирации, приводящую к измерению всех ранее упомянутых параметров.
Introduction
Гигантские пузырьки, полученные из фосфолипидов (липосомы) широко используются с 1970-х годов в качестве основной модели клеточной мембраны1. В конце 1990-х годов везикулярные морфологии, полученные из самосборки кополимеров, названных полимеромпомы по отношению к их липидным аналогам2,3, быстро появились как интересная альтернатива липосом, обладающим слабой механической устойчивостью и плохой модульной химической функциональностью. Однако, их биомиметический характер клетки довольно лимитирован сравненный к липосомам в виду того что последние составлены фосфолипидов, главным образом компонентом мембраны клетки. Кроме того, их низкая проницаемость мембраны может быть проблемой в некоторых приложениях, таких как доставка лекарств, где требуется контролируемое распространение видов через мембрану. В последнее время, связь фосфолипидов с блоком кополимеров для разработки гибридных полимерно-липидных пузырьков и мембран был предметом все большего числа исследований4,5. Основная идея заключается в разработке объектов, которые синергетически сочетают преимущества каждого компонента (биофункциональность и проницаемость липидных бислой с механической стабильностью и химической универсальностью полимеров), которые могут быть использованы в различных приложениях: контролируемая и целевая доставка лекарств, биомолекулярное распознавание в рамках биосенсоров для диагностики, функциональные мембраны для искусственных клеток, развитие био-вдохновленных микро-/нанореакторов.
В настоящее время различные научные сообщества (биохимики, химики, биофизики, физики-химики, биологи) проявляют все больший интерес к разработке более продвинутой модели клеточных мембран. Здесь наша цель состоит в том, чтобы представить, как подробно, как это возможно, существующие методологии (электроформация, микропипетус аспирации), чтобы получить и охарактеризовать механические свойства гигантских пузырьков и последние “продвинутые” модели клеточных мембран, которые являются гибридными полимерными липидными гигантскими пузырьками4,5.
Целью этих методов является получение надежного измерения области сжатия и изгиба модули мембраны, а также их лиза т.д. напряжения и напряжения. Одним из наиболее распространенных методов, существующих для измерения жесткости изгиба гигантского везикулы является анализ колебаний6,7, на основе прямого наблюдения видеомикроскопа; но это требует больших видимых колебаний мембран и не получается систематически на толстых мембранах (например, полимеросомы). Модули сжатия области можно экспериментально определить с помощью техники Langmuir Blodgett, но чаще всего на монослой8. Метод аспирации микропипет позволяет измерять оба модули на двухслойном, образуя гигантский unilamellar vesicle (GUV) в одном эксперименте.
Следующий метод подходит для всех молекул амфифилов или макромолекул, способных образовывать двуслойные и, следовательно, пузырьки электроформации. Это требует жидкого характера двухслойного при температуре электроформации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Покрытие микропипетта является одним из ключевых моментов для получения надежных измерений. Прилипание везикулы к микропипетету должно быть предотвращено, и покрытие обычно используется в литературе17,18,19,20,<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью признают ANR за финансовую поддержку (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
Referências
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
