Obtención de vesículas híbridas unilamelares gigantes por electroformación y medición de sus propiedades mecánicas por aspiración de micropipeta
Summary
El objetivo del protocolo es medir de forma fiable las propiedades mecánicas de membrana de las vesículas gigantes por aspiración de micropipetas.
Abstract
Las vesículas gigantes obtenidas a partir de fosfolípidos y copolímeros pueden explotarse en diferentes aplicaciones: administración controlada y dirigida de fármacos, reconocimiento biomolecular dentro de biosensores para el diagnóstico, membranas funcionales para células artificiales y desarrollo de micro/nanorreactores bioinspirados. En todas estas aplicaciones, la caracterización de sus propiedades de membrana es de importancia fundamental. Entre las técnicas de caracterización existentes, la aspiración de micropipetas, pionera por E. Evans, permite la medición de las propiedades mecánicas de la membrana, como el módulo de compresibilidad de área, el módulo de flexión y la tensión y la tensión de lisis y la tensión y la tensión. Aquí, presentamos todas las metodologías y procedimientos detallados para obtener vesículas gigantes a partir de la película delgada de un lípido o copolímero (o ambos), la fabricación y tratamiento superficial de micropipetas, y el procedimiento de aspiración que conduce a la medición de todos los parámetros mencionados anteriormente.
Introduction
Las vesículas gigantes obtenidas a partir de fosfolípidos (liposomas) han sido ampliamente utilizadas desde la década de 1970 como la membrana celular básica modelo1. A finales de la década de 1990, las morfologías vesiculares obtenidas del autoensamblaje de copolímeros, denominados polímeros en referencia a sus análogos de lípidos2,3,aparecieron rápidamente como una alternativa interesante a los liposomas que poseen una débil estabilidad mecánica y una pobre funcionalidad química modular. Sin embargo, su carácter biomimético celular es bastante limitado en comparación con los liposomas ya que estos últimos están compuestos de fosfolípidos, el componente principal de la membrana celular. Además, su baja permeabilidad a la membrana puede ser un problema en algunas aplicaciones como la administración de fármacos donde se requiere la difusión controlada de especies a través de la membrana. Recientemente, la asociación de fosfolípidos con copolímeros de bloque para diseñar vesículas y membranas híbridas de polímero-lípido sha sido objeto de un número creciente de estudios4,5. La idea principal es diseñar entidades que combinen sinérgicamente los beneficios de cada componente (biofuncionalidad y permeabilidad de las bicapas lipídicas con la estabilidad mecánica y versatilidad química de las membranas poliméricas), que pueden ser explotadas en diferentes aplicaciones: entrega controlada y dirigida de fármacos, reconocimiento biomolecular dentro de biosensores para el diagnóstico, membranas funcionales para células artificiales, desarrollo de micro-nano-reactores bioinspirados.
Hoy en día, diferentes comunidades científicas (bioquímicos, químicos, biofísicos, físico-químicos, biólogos) tienen un creciente interés en el desarrollo de un modelo de membrana celular más avanzado. Aquí, nuestro objetivo es presentar, lo más detalladamente posible, metodologías existentes (electroformación, aspiración de micropipetas) para obtener y caracterizar las propiedades mecánicas de las vesículas gigantes y los recientes modelos de membrana celular “avanzados” que son vesículas gigantes de lípidos de polímero híbrido4,5.
El propósito de estos métodos es obtener una medición fiable de la compresibilidad de la zona y los módulos de flexión de la membrana, así como su tensión de lisis y tensión. Una de las técnicas más comunes existentes para medir la rigidez de flexión de una vesícula gigante es el análisis de fluctuación6,7, basado en la observación directa del microscopio de vídeo; pero esto requiere una gran fluctuación visible de la membrana, y no se obtiene sistemáticamente en membranas gruesas (por ejemplo, polímeros). El módulo de compresibilidad de área se puede determinar experimentalmente utilizando la técnica Langmuir Blodgett, pero más a menudo en una monocapa8. La técnica de aspiración de micropipetas permite la medición de ambos módulos en una bicapa formando vesícula unilamellar gigante (GUV) en un experimento.
El siguiente método es adecuado para todas las moléculas anfifílicas o macromoléculas capaces de formar bicapas y, en consecuencia, vesículas por electroformación. Esto requiere un carácter fluido de la bicapa a la temperatura de la electroformación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El recubrimiento del micropipeta es uno de los puntos clave para obtener mediciones fiables. Se debe evitar la adhesión de la vesícula a la micropipeta, y se utiliza comúnmente un recubrimiento en la literatura17,18,19,20,21, con BSA, é-caseína o surfasil. Los detalles del procedimiento de recubrimiento rara vez se mencionan.
L…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la ANR su apoyo financiero (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
Referências
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