Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten
Summary
Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.
Abstract
Astrocyten behoren tot de meest overvloedige celtypen in het volwassen brein, waar ze belangrijke rollen spelen in een veelheid van functies. Als een centrale speler in de hersenen homeostase, astrocyten leveren neuronen met vitale metabolieten en buffer extracellulaire water, ionen, en glutamaat. Een integraal onderdeel van de “Tri-partite” Synapse, astrocyten zijn ook kritisch in de vorming, snoeien, onderhoud, en modulatie van synapsen. Om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling en met andere gliacellen, neuronen, de hersen-vasculatuur en de extracellulaire omgeving door een veelheid aan gespecialiseerde membraan eiwitten die cel bevatten adhesiemoleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporters, en gap-junction moleculen. Ter ondersteuning van deze dynamische flux, zijn astrocyten, net als neuronen, afhankelijk van strak gecoördineerd en efficiënt intracellulair transport. In tegenstelling tot neuronen, waar intracellulaire handel uitgebreid is afgebakend, is het op microtubulus gebaseerde transport in astrocyten minder bestudeerd. Niettemin, Exo-en endocytaire handel in celmembraan eiwitten en intracellulaire organel transport regelt de normale biologie van astrocyten, en deze processen worden vaak aangetast door ziekte of als reactie op letsel. Hier presenteren we een eenvoudig protocol om hoge kwaliteit Murine astrocyten te kweken, om astrocytische eiwitten en organellen van belang fluorescentisch te labelen en om hun intracellulaire transport dynamiek op te nemen met behulp van time-lapse confocale microscopie. We laten ook zien hoe relevante transport parameters uit de gekochte films kunnen worden uitgepakt en gekwantificeren met behulp van de beschikbare software voorbeeld analyse (d.w.z. ImageJ/FIJI) plugins.
Introduction
Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel van de volwassene, waar ze unieke ontwikkelings-en homeostatische functies uitvoeren1. Astrocyten moduleren synaptische ontwikkeling door direct contact met pre-en postsynaptisch terminals als onderdeel van de Tri-partite Synapse, die bevat neurotransmitter receptoren, transporters, en celadhesie moleculen die Synapse vorming vergemakkelijken en neuron-astrocyten communicatie2. Bovendien, astrocyten actief controle synaptische transmissie en voorkomen neuronale excitotoxicity door het snel verwijderen van excitatory neurotransmitters uit de synaptische gespleten, recycling neurotransmitters, en deelnemen aan synaptische snoeien3 , 4 , 5 , 6. om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling, met andere gliacellen en met neuronen via gespecialiseerde membraan proteïnen, waaronder celadhesie moleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporteurs, en gap junction moleculen. Astrocyten veranderen actief de oppervlakte niveaus van deze eiwitten in reactie op schommelingen in hun intra-en extracellulaire omgeving7. Bovendien, veranderingen in de niveaus en de verdeling van de mitochondriën, lipide druppeltjes, en degradatieve en recycling organellen moduleren energietoevoer, metaboliet beschikbaarheid, en cellulaire clearing processen die essentieel zijn voor de functie van de astrocyten en Overleving.
De dynamische veranderingen in membraan proteïne en organel-handel en positionering in astrocyten worden vergemakkelijkt door de gezamenlijke functie van motor eiwitten en adapters die de beweeglijkheid van de lading bevorderen8,9. Evenzo worden de oppervlakte niveaus van membraan proteïnen gemoduleerd door middel van internalisatie en recycling evenementen10. Deze cargo’s worden getransporteerd via een ingewikkeld netwerk van actin, microtubuli, en eventueel tussenliggende filamenten tracks8. Studies op basis van immunofluorescentie kleuring van end-binding proteïne 1 (EB1), die zich ophogt bij de groeiende microtubulus plus uiteinden, suggereren dat in astrocyten bundels van microtubuli uit de perinucleons uitstralen en hun plus einde uitbreiden naar de periferie11. Echter, een uitgebreid onderzoek van de organisatie en de polariteit van microtubuli en andere cytoskelet elementen met behulp van Live-celbeeldvorming ontbreekt nog. Hoewel veel van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de dynamiek van organellen en membraan eiwitten uitvoerig zijn bestudeerd in neuronen en andere celtypen, is de beweeglijkheid van de lading in astrocyten minder goed begrepen. De meeste van onze huidige kennis over veranderingen in de eiwit-en organel verdeling in astrocyten is gebaseerd op traditionele etikettering van vaste stoffen op basis van antilichamen, die het precieze ruimtelijke en temporele onderzoek van Cargo Dynamics7uitsluit, 12.
Hier beschrijven we een methode om membraan eiwitten en organellen te labelen voor Live beeldvorming in primaire muis astrocyten culturen. Met behulp van dit protocol, bieden we voorbeelden waarin we de dynamische lokalisatie van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde membraan eiwitten in getransfunteerde astrocyten, waaronder de gap junction Protein connexin 43 (Cx43-GFP) en het excitatory aminozuur Transporter 1 (EAAT1-GFP). We beschrijven ook het gebruik van een fluorescerende acidotrope sonde om zure organellen te visualiseren en de dynamiek van hun handel in levende astrocyten te volgen. Ten slotte laten we zien hoe u de timelapse-gegevens analyseert om transport parameters voor individuele ladingen te extraheren en te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een experimentele aanpak om fluorescently gelabelde organellen en membraan eiwitten van belang te uiten, visualiseren en volgen met behulp van time-lapse video microscopie in hoge zuiverheid primaire muis corticale MD astrocyten. We schetsen ook een methodologie voor het meten van de deeltjes dynamiek. Directe visualisatie van eiwitten en organel dynamica in primaire astrocyten biedt een krachtig hulpmiddel om de regulering van intracellulair transport in deze cellen in vitro te bestuderen.
<p cla…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL werd gesteund door de University of North Carolina op Chapel Hill (UNC) school of Medicine als Simmons-geleerde. TWR werd ondersteund door UNC PREP Grant R25 GM089569. Werk met behulp van de UNC Neuroscience Center microscopie kern faciliteit werd ondersteund, gedeeltelijk, door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center ondersteuning Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD intellectuele en ontwikkelingsstoornissen Research Center ondersteuning subsidie U54 HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
Referências
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
