Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos
Summary
Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.
Abstract
Os astrocytes estão entre os tipos os mais abundantes da pilha no cérebro adulto, onde jogam papéis chaves em um multiplicidade das funções. Como um jogador central na homeostase cerebral, os astrócitos fornecem neurônios com metabólitos vitais e água tampão extracelular, íons e glutamato. Um componente integrante da sinapse “Tri-partite”, os astrócitos também são críticos na formação, poda, manutenção e modulação das sinácias. Para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si e com outras células gliais, neurônios, vasculatura cerebral e o ambiente extracelular através de uma infinidade de proteínas de membrana especializadas que incluem células moléculas de adesão, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Para apoiar este fluxo dinâmico, astrocytes, como neurônios, dependem de transporte intracelular firmemente coordenado e eficiente. Ao contrário dos neurônios, onde o tráfico intracelular tem sido extensivamente delineado, o transporte baseado em microtúcitos em astrócitos tem sido menos estudado. No entanto, o tráfico EXO-e endocítico de proteínas da membrana celular e o transporte intracelular de organela orquestram a biologia normal dos astrócitos, e esses processos são freqüentemente afetados na doença ou em resposta a lesões. Aqui nós apresentamos um protocolo direto aos astrocytes murino da alta qualidade da cultura, às proteínas astrocytic da etiqueta cDNAs e aos organelas do interesse, e para gravar sua dinâmica intracelular do transporte usando a microscopia confocal do tempo-lapso. Também demonstramos como extrair e quantificar os parâmetros de transporte relevantes dos filmes adquiridos usando o software de análise de imagem disponível (ou seja, ImageJ/FIJI) plugins.
Introduction
Os astrocytes são as pilhas as mais abundantes no sistema nervoso central adulto, onde executam funções desenvolventes e homeostático originais1. Os astrócitos modulam o desenvolvimento sináptico através do contato direto com terminais pré e pós-sinápticos como parte da sinapse Tri-partite, que contém receptores de neurotransmissores, transportadores e moléculas de adesão celular que facilitam a formação de sinapse e comunicação do Neuron-astrocyte2. Além disso, os astrócitos controlam ativamente a transmissão sináptica e impedem a excitotoxicidade neuronal removendo rapidamente neurotransmissores excitatórios da fenda sináptica, reciclando neurotransmissores e participando da poda sináptica3 , 4. º , 5. º , 6. para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si, com outras células gliais, e com neurônios através de proteínas de membrana especializadas, incluindo moléculas de adesão celular, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Os astrocytes mudam ativamente os níveis de superfície destas proteínas em resposta às flutuações em seu ambiente intra e extracelular7. Além disso, mudanças nos níveis e na distribuição de mitocôndrias, gotículas lipídicas e organelas degradantes e recicladoras modulam o suprimento energético, a disponibilidade de metabolito e os processos de compensação celular que são essenciais para a função de astrocite e Sobrevivência.
As mudanças dinâmicas na proteína da membrana e no tráfico de organelas e posicionamento em astrócitos são facilitadas pela função concertada das proteínas motoras e dos adaptadores que promovem a motilidade de carga8,9. Da mesma forma, os níveis superficiais das proteínas da membrana são modulados através de eventos de internalização e reciclagem10. Estas cargas são transportadas através de uma intrincada rede de actina, microtúbulos e, possivelmente, faixas de filamentos intermediários8. Os estudos baseados na coloração da imunofluorescência da proteína de ligação final 1 (EB1), que se acumula no microtubule mais extremidades crescentes, sugerem que nos astrócitos os feixes dos microtúbulos irradiam para fora do perinucleus e estenda sua extremidade mais para a periferia11. Entretanto, uma examinação detalhada da organização e da polaridade dos microtúbulos e de outros elementos cytoesqueléticos usando a imagem latente da vivo-pilha é ainda falta. Embora muitos dos mecanismos subjacentes à dinâmica das organelas e das proteínas da membrana tenham sido extensivamente estudados em neurônios e outros tipos de células, a motilidade da carga nos astrócitos é menos bem compreendida. A maioria de nosso conhecimento atual sobre mudanças na distribuição da proteína e do organela nos astrócitos é baseada na rotulagem anticorpo-baseada tradicional da preparação fixa, que impede o exame espacial e temporal preciso da dinâmica de carga7, doze anos.
Aqui, nós descrevemos um método para etiquetar proteínas e organelas da membrana para a imagem latente viva em culturas preliminares do astrocyte do rato da pureza elevada. Usando este protocolo, nós fornecemos exemplos em que nós rastreamos a localização dinâmica de proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetada proteínas de membrana em astrocytes transfected, incluindo a junção de Gap proteína conexina 43 (Cx43-GFP) e o aminoácido excitatória transportador 1 (EAAT1-GFP). Nós igualmente descrevemos o uso de uma ponta de prova acidotropic fluorescente para visualizar organelas ácidos e para seguir sua dinâmica do tráfico em astrocytes vivos. Finalmente, demonstramos como analisar os dados de lapso de tempo para extrair e avaliar os parâmetros de transporte para cargas individuais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos uma abordagem experimental para expressar, Visualizar e rastrear organelas fluorescentamente marcadas e proteínas de membrana de interesse usando a microscopia de vídeo de lapso de tempo em astrocytes de MD cortical do mouse primário de alta pureza. Também Delineamos uma metodologia para medir a dinâmica das partículas. A visualização direta da dinâmica protéica e organela nos astrócitos primários fornece uma poderosa ferramenta para estudar a regulação do transporte intracelular nessas c?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL foi apoiado pela Universidade da Carolina do Norte na Chapel Hill (UNC) escola de medicina como um estudioso Simmons. O TWR foi apoiado pelo UNC PREP Grant R25 GM089569. Trabalho usando o centro de neurociência UNC microscopia núcleo Facility foi apoiado, em parte, pelo financiamento do NIH-NINDS Neuroscience Center support Grant p30 NS045892 e o NIH-NICHD intelectual e desenvolvimento apoio centro de pesquisa subsídio U54 HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
Referências
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