הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם
Summary
תרבויות תלת ממדיות של החולה BMPC דגימות ו xenografts של סרטן הערמונית גרורתי העצם לשמור על טרוגניות תפקודית של גידולים המקורי שלהם וכתוצאה מכך ציסטות, spheroids ו מורכבים, גידול כמו אורגנואידים. כתב יד זה מספק אסטרטגיה מיטוב ופרוטוקול לתרבות תלת-ממדית של מטופלים הטרוגנית דגימות נגזרות והניתוח שלהם באמצעות IFC.
Abstract
תלת מימדי (3d) תרבות של אורגנואידים מתוך דגימות הגידול של חולים אנושיים והמטופל נגזר מבע (pdx) מודלים של סרטן הערמונית, המכונה מטופל נגזר החולה (pdo), הם משאב לא יסולא בפז ללמוד את המנגנון של טווריגנזה וגרורה של סרטן הערמונית. היתרון העיקרי שלהם הוא שהם לשמור על גנומית ייחודי ופונקציונלי טרוגניות של רקמת המקורי לעומת קווי תאים קונבנציונליים כי לא. יתר על כן, התרבויות 3D של PDO יכול לשמש כדי לנבא את ההשפעות של טיפול בסמים על חולים בודדים הם צעד לקראת הרפואה אישית. למרות היתרונות הללו, קבוצות מעטות משתמשות בשיטה זו באופן שגרתי במסגרת המיטוב הנרחב של תנאי התרבות PDO העשויים להידרש לדגימות מטופלים שונים. בעבר הדגמנו כי סרטן הערמונית שלנו עצם גרורות PDX מודל, PCSD1, לכידה ההתנגדות של גרורות העצם של המטופל תורם לטיפול אנטי אנדרוגן. השתמשנו PCSD1 3D אורגנואידים כדי לאפיין עוד את המנגנונים של אנטי אנדרוגן התנגדות. בעקבות סקירה של מחקרים שפורסמו כעת של PDX ו-PDO מודלים, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור תרבות תלת-ממד של PDO באמצעות ממברנה כיפה או צפה מרתף (g., מטריצות) ספירות בתנאים התרבותיים אופטימיזציה. ב vivo תפר הדמיה ועיבוד תאים עבור היסטולוגיה מתוארים גם. פרוטוקול זה יכול להיות אופטימיזציה נוספת עבור יישומים אחרים, כולל אבן חשופה מערבית, שיתוף תרבות, וכו ‘ והוא יכול לשמש כדי לחקור את המאפיינים של PDO תרבותי תלת-ממד המתייחס התנגדות לסמים, tuמוריגנזה, גרורות ו therapeutics.
Introduction
האורגנואידים התלת-ממדיים משכו תשומת לב ליכולתם ללכוד את הvivo באדריכלות, הפונקציונליות התאית והחתימה הגנטית של הרקמות המקוריות שלהם1,2,3,4,5. החשוב ביותר, 3d אורגנואידים הוקמה מרקמות סרטן החולה או המטופל נגזר מבע (pdx) מודלים לספק הזדמנויות לא יסולא בפז להבין מנגנונים של איתות סלולרי על טומגנזה וכדי לקבוע את ההשפעות של טיפול בסמים על כל אוכלוסייה תא6,7,8,9,10,11,12,13. דרוסט ואח ‘5 פיתח פרוטוקול סטנדרטי להקמת אורגנואידים של האדם והעכבר, אשר אומצה באופן נרחב בתחום של אורולוגיה. בנוסף, מאמץ משמעותי הוקדש לאפיון נוסף של 3d אורגנואידים ולהבין את המנגנונים המפורטים של tuמוריגנזה ו גרורות4,12,14,15. בנוסף לפרוטוקול שהוקם בעבר ומקובל ביותר עבור תרבויות 3D אורגנואידים, אנו מתארים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד עבור תרבות תלת-ממד של PDO באמצעות שלוש שיטות שונות doming בתנאי תרבות אופטימיזציה.
בכתב יד זה, 3D אורגנואידים הוקמו כמודל vivo ex של סרטן הערמונית גרורתי העצם (BMPC). התאים המשמשים עבור תרבויות אלה הגיעו מסרטן הערמונית סן דייגו (pcsd) סדרה ונגזר ישירות החולה סרטן הערמונית העצם גרורות רקמות גידולים (PCSD18 ו PCSD22) או החולה נגזר מבע (pdx) מודלים סרטניים (דגימות בשם PCSD1, PCSD13, ו PCSD17). מכיוון גרורות עצם ספונטנית של תאים סרטניים בערמונית נדיר במודלים מהונדסים גנטית העכבר16, השתמשנו ישירה הירך (IF) הזרקה של תאים סרטניים האדם לתוך זכר Rag2-/-γc– עכברים להקמת מודלים pdx של סרטן הערמונית גרורתי עצם17.
ברגע שאורגנואיד 3D הוקמו תאים סרטניים הטרוגנית החולה או המטופל נגזר xenografts, זה חיוני כדי לאשר את זהותם כמו תאים סרטניים בערמונית כדי לקבוע פנוטיפים שלהם בתרבויות 3D אורגאיד. אימונולובורנציה כימיה (IFC) מאפשר הדמיה של ביטוי החלבון באתרו בכל תא, לעתים קרובות מציין את הפונקציות הפוטנציאליות עבור אוכלוסיות תאים ספציפיות2,4. באופן כללי, פרוטוקולים IFC עבור רוב המכריע של דגימות כולל רקמות ותאים פשוטים וממוטבים לחלוטין. עם זאת, צפיפות התא ומספר האורגנואידים יכולים להיות נמוכים באופן משמעותי מזו של התרבות המקובלת. לכן, פרוטוקול IFC עבור אורגנואידים דורש צעדים נוספים כדי להבטיח עיבוד תקין והטבעה של פרפין עבור כל אורגנואידים בדגימות. אנו מתארים שלבים נוספים עבור תהליך הטמעה מראש וטיפים כדי לתייג את המיקום של האורגנואידים מנות בשקופית המגביר את שיעור ההצלחה של IFC על אורגנואידים במיוחד כאשר דגימות של האורגנואידים יש צפיפות תא נמוכה יותר מאשר הרצוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
אורגנואידים תלת-ממדיים שנגזר מעצם החולה גרורות בתאי סרטן הערמונית הם עדיין נדירים יחסית. כאן, אנו מתארים אסטרטגיות אופטימיזציה נוספת הפרוטוקול להקים בהצלחה החולה 3D סדרתי המטופל הנגזר (PDOs) של BMPC. בנוסף, הפרוטוקולים מתוארים כדי לאבטח את האורגנואידים בדגימות עם צפיפות תאים נמוכה יותר עבור IFC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן מזל אריה ואן אלברט וקרן JM. אנו מודים לאוניברסיטה של קליפורניה בסן דייגו מורס מרכז הסרטן חברי, ד ר. ג’ינג יאנג וד ר קיי ט. י. המאפשר לנו להשתמש במיקרוטומה שלהם ובצרפתית רנדל, המחלקה לכירורגיה למומחיות טכנית.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
Referências
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
