إنشاء وتحليل الأرغن ثلاثيالأبعاد (3D) المستمدة من عينات الانبثاث العظام سرطان البروستاتا المريض وXenografts بهم
Summary
الثقافات ثلاثية الأبعاد من عينات BMPC المريض وxenografts من سرطان البروستاتا النقيلي العظام الحفاظ على التغايرية الوظيفية للأورام الأصلية مما أدى إلى الخراجات، وspheroids ومعقدة، مثل الورم organoids. توفر هذه المخطوطة استراتيجية وبروتوكولًا أمثل للثقافة ثلاثية الأبعاد للعينات المشتقة من المرضى غير المتجانسة وتحليلها باستخدام مؤسسة التمويل الدولية.
Abstract
ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة organoids من عينات الورم من المرضى الإنسان ونماذج xenograft (PDX) المستمدة من المريض من سرطان البروستاتا ، ويشار إلى organoids المستمدة من المريض (PDO) ، هي مورد لا يقدر بثمن لدراسة آلية ورم ورم وورم سرطان البروستاتا. ميزتها الرئيسية هي أنها تحافظ على التغايرية الجينومية والوظيفية المميزة للأنسجة الأصلية مقارنة بخطوط الخلايا التقليدية التي لا تفعل ذلك. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لـ PDO للتنبؤ بآثار العلاج الدوائي على المرضى الأفراد وهي خطوة نحو الطب الشخصي. على الرغم من هذه المزايا، عدد قليل من المجموعات بشكل روتيني استخدام هذا الأسلوب في جزء منه بسبب التحسين واسعة النطاق من الظروف ثقافة PDO التي قد تكون مطلوبة لعينات المرضى المختلفة. لقد أثبتنا سابقًا أن نموذج PDX لسرطان البروستاتا هو نموذج PDX ، PCSD1 ، لخص مقاومة الانبثاث العظمي للمريض المتبرع للعلاج المضاد للاندروجين. استخدمنا PCSD1 3D organoids لتوصيف المزيد من آليات مقاومة مضادة للاندروجين. بعد نظرة عامة على الدراسات المنشورة حاليًا لنماذج PDX و PDO ، نصف بروتوكولًا تدريجيًا لثقافة ثلاثية الأبعاد لـ PDO باستخدام أغشية الطابق السفلي المقببة أو العائمة (على سبيل المثال ، Matrigel) في ظروف الثقافة المحسنة. في التصوير غرزة الجسم الحي ومعالجة الخلايا لعلم الأنسجة كما وصفت. ويمكن تحسين هذا البروتوكول كذلك لتطبيقات أخرى بما في ذلك لطخة الغربية، والثقافة المشتركة، وما إلى ذلك، ويمكن استخدامها لاستكشاف خصائص PDO مثقف 3D المتعلقة مقاومة الدواء، والورم، والانبثاث والعلاجات.
Introduction
وقد لفتت organoids ثلاثية الأبعاد المستزرعة الانتباه لقدرتها على تلخيص العمارة في الجسم الحي ، والوظائف الخلوية والتوقيع الجيني للأنسجة الأصلية1،2،3،4،5. الأهم من ذلك ، organoids 3D المنشأة من أنسجة الورم المريض أو المريض المستمدة xenograft (PDX) نماذج توفر فرصا لا تقدر بثمن لفهم آليات الإشارات الخلوية على تكوين الورم وتحديد آثار العلاج الدوائي على كل خلية من السكان6،7،8،9،10،11،12،13. وضعت Drost وآخرون5 بروتوكولًا قياسيًا لإنشاء أجهزة البروستاتا البشرية والفأرة ، والتي تم اعتمادها على نطاق واسع في مجال المسالك البولية. وبالإضافة إلى ذلك، تم تكريس جهد كبير لمزيد من توصيف الأجهزة 3D وفهم آليات مفصلة من الورم والانبثاث4،12،14،15. بالإضافة إلى البروتوكول الذي تم إنشاؤه مسبقًا والمقبول على نطاق واسع لثقافات الأجهزة ثلاثية الأبعاد ، فإننا نصف هنا بروتوكولًا خطوة بخطوة لثقافة 3D من PDO باستخدام ثلاث طرق مختلفة للقباب في ظروف الثقافة المثلى.
في هذه المخطوطة، تم تأسيس الأرغن ثلاثية الأبعاد كنموذج جديد لسرطان البروستاتا النقيلي العظمي (BMPC). جاءت الخلايا المستخدمة لهذه الثقافات من سلسلة سرطان البروستاتا سان دييغو (PCSD) واستمدت مباشرة من سرطان البروستاتا المريض أنسجة الورم النقيلي العظام (PCSD18 و PCSD22) أو المريض المستمدة xenograft (PDX) نماذج الورم (عينات تسمى PCSD1، PCSD13، و PCSD17). لأن الانبثاث العظام التلقائي ة من خلايا سرطان البروستاتا أمر نادر الحدوث في نماذج الماوس المعدلة وراثيا16، استخدمنا مباشرة داخل الفخذ (IF) حقن خلايا الورم البشري في Rag2 الذكور-/-οc-/- الفئران لإنشاء نماذج PDX من سرطان البروستاتا النقيلي العظام17.
مرة واحدة يتم إنشاء organoids 3D من الخلايا السرطانية المريض غير متجانسة أو xenografts المريض المستمدة، فمن الضروري لتأكيد هويتهم كخلايا ورم البروستاتا وتحديد الأنماط الظاهرية في الثقافات الاعضاء 3D. تسمح كيمياء الفلورة المناعية (IFC) بتصور التعبير البروتيني في الموقع في كل خلية ، مما يشير في كثير من الأحيان إلى الوظائف المحتملة لتجمعات خلايا محددة2،4. بشكل عام، بروتوكولات مؤسسة التمويل الدولية للغالبية العظمى من العينات بما في ذلك الأنسجة والخلايا واضحة والأمثل تماما. ومع ذلك ، يمكن أن تكون كثافة الخلايا وعدد الاعضاء أقل بكثير من الثقافة التقليدية. ولذلك، فإن بروتوكول مؤسسة التمويل الدولية للأعضاء يتطلب خطوات إضافية لضمان المعالجة السليمة والتضمين في البارافين لجميع الأرغن في العينات. نحن نصف خطوات إضافية لعملية تضمين أغاروز المسبقة ونصائح لتسمية موقع الأجزاء الاعضاء على الشريحة التي تزيد من معدل نجاح مؤسسة التمويل الدولية على organoids خاصة عندما تكون عينات من organoids كثافة خلايا أقل من المطلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا تزال الأجهزة ثلاثية الأبعاد المشتقة من خلايا سرطان البروستاتا الانبثاث العظمي للمريض نادرة نسبيًا. هنا ، ونحن نصف الاستراتيجيات والبروتوكول الأمثل كذلك إلى إنشاء بنجاح المسلسل 3D المريض المشتقة organoids (PDOs) من BMPC. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف البروتوكولات لتأمين الأورجادات في عينات ذات كثا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة مؤسسة ليو وآن ألبرت الخيرية ومؤسسة JM. نشكر جامعة كاليفورنيا سان دييغو مورز أعضاء مركز السرطان، والدكتور جينغ يانغ والدكتور كاي ت. يونغ للسماح لنا باستخدام الميكروتومي وراندال الفرنسية، قسم الجراحة للخبرة التقنية.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
Referências
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
