Oprichting en analyse van driedimensionale (3D) organoïden afgeleid van patiënt prostaatkanker Bot metastase Specimens en hun Xenografts
Summary
Driedimensionale culturen van patiënt BMPC-specimens en xenografts van botgemetastaseerde prostaatkanker behouden de functionele heterogeniteit van hun oorspronkelijke tumoren, wat resulteert in cysten, sferoïden en complexe, tumorachtige organoïden. Dit manuscript biedt een optimalisatiestrategie en protocol voor de 3D-cultuur van heterogene patiëntafgeleide monsters en hun analyse met behulp van IFC.
Abstract
Driedimensionale (3D) cultuur van organoïden uit tumorspecimens van menselijke patiënten en door patiënten afgeleide xenograft (PDX) modellen van prostaatkanker, aangeduid als patiënt-afgeleide organoïden (BOB), zijn een onschatbare bron voor het bestuderen van het mechanisme van tumorigenese en metastase van prostaatkanker. Hun belangrijkste voordeel is dat ze de kenmerkende genomische en functionele heterogeniteit van het oorspronkelijke weefsel behouden in vergelijking met conventionele cellijnen die dat niet doen. Bovendien kunnen 3D-culturen van BOB worden gebruikt om de effecten van medicamenteuze behandeling op individuele patiënten te voorspellen en zijn een stap in de richting van gepersonaliseerde geneeskunde. Ondanks deze voordelen, weinig groepen routinematig gebruik maken van deze methode voor een deel vanwege de uitgebreide optimalisatie van BOB cultuur voorwaarden die nodig kunnen zijn voor verschillende patiënt monsters. We hebben eerder aangetoond dat ons BOT-metastase PDX-model voor prostaatkanker, PCSD1, de resistentie van de botmetastase van de donorpatiënt tegen anti-androgeentherapie recapituleerde. We gebruikten PCSD1 3D-organoïden om de mechanismen van anti-androgeenweerstand verder te karakteriseren. Naar aanleiding van een overzicht van de momenteel gepubliceerde studies van PDX- en BOB-modellen beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van BOB met behulp van koepelvormige of zwevende keldermembraan (bijvoorbeeld Matrigel) bollen in geoptimaliseerde kweekomstandigheden. In vivo worden ook steekbeeldvorming en celverwerking voor histologie beschreven. Dit protocol kan verder worden geoptimaliseerd voor andere toepassingen, waaronder westerse vlek, co-cultuur, enz.
Introduction
Driedimensionale gekweekte organoïden hebben de aandacht gevestigd op hun potentieel om de in vivo architectuur, cellulaire functionaliteit en genetische signatuur van hun oorspronkelijke weefsels1,2,3,4,5, te recapituleren. Het belangrijkste is dat 3D-organoïden die zijn vastgesteld uit tumorweefsels van patiënten tumoren of door de patiënt afgeleide xenograft (PDX)-modellen onschatbare mogelijkheden bieden om mechanismen van cellulaire signalering bij tumorigenese te begrijpen en de effecten van medicamenteuze behandeling op elke celpopulatie te bepalen6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 ontwikkelden een standaardprotocol voor de oprichting van menselijke en muizenprostaatorganoïden, dat op grote schaal is aangenomen op het gebied van urologie. Daarnaast is aanzienlijke inspanning besteed aan verdere karakterisering van 3D-organoïden en om de gedetailleerde mechanismen van tumorigenese en metastasetebegrijpen 4,12,14,15. Naast het eerder vastgestelde en algemeen aanvaarde protocol voor 3D-organoïdenculturen, beschrijven we hier een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van bobdo met behulp van drie verschillende domingmethoden in geoptimaliseerde cultuuromstandigheden.
In dit manuscript werden 3D-organoïden opgericht als een ex vivo model van botgemetastase prostaatkanker (BMPC). De cellen die voor deze culturen worden gebruikt, kwamen uit de Prostate Cancer San Diego (PCSD) serie en werden rechtstreeks afgeleid van botuitgezaaide tumorweefsels van patiënten (PCSD18 en PCSD22) of tumormodellen van patiënt afgeleide xenograft (PDX) (monsters genaamd PCSD1, PCSD13 en PCSD17). Omdat spontane botmetastase van prostaatkankercellen zeldzaam is in genetisch gemanipuleerde muismodellen16, gebruikten we directe intra-femorale (IF) injectie van menselijke tumorcellen in mannelijke Rag2-/-γc-/- muizen om de PDX-modellen van botgemetastase prostaatkanker vast te stellen17.
Zodra 3D-organoïden zijn gevestigd uit heterogene tumorcellen van patiënten of door de patiënt afgeleide xenografts, is het essentieel om hun identiteit als prostaattumorcellen te bevestigen en hun fenotypes in de 3D-organoïde culturen te bepalen. Immunofluorescentiechemie (IFC) maakt de visualisatie van eiwitexpressie in situ in elke cel mogelijk, waarbij vaak de potentiële functies voor specifieke celpopulaties2,4worden aangegeven. In het algemeen zijn IFC-protocollen voor een overgrote meerderheid van de monsters, waaronder weefsels en cellen, eenvoudig en volledig geoptimaliseerd. De celdichtheid en het aantal organoïden kunnen echter aanzienlijk lager zijn dan die van de conventionele cultuur. Daarom vereist het IFC-protocol voor organoïden extra stappen om te zorgen voor een goede verwerking en inbedding in paraffine voor alle organoïden in de monsters. We beschrijven extra stappen voor een agarose pre-inbedding proces en tips om de locatie van gesectioneerde organoïden label op de dia die het slagingspercentage van IFC op organoïden verhoogt vooral wanneer de monsters van organoïden hebben een lagere celdichtheid dan gewenst.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D-organoïden afkomstig van patiënt botmetastase prostaatkankercellen zijn nog relatief zeldzaam. Hier beschrijven we strategieën en verder geoptimaliseerd protocol om met succes gevestigde seriële 3D-patiënt afgeleide organoïden (PDOs) van BMPC. Daarnaast worden protocollen beschreven om de organoïden te beveiligen in monsters met een lagere celdichtheid voor IFC- en IHC-analyse. Differentiële fenotypes in de vorm van cyste, sferoïden en complexere organoïden geven aan dat dit protocol kweekcondities biedt die…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Leo en Anne Albert Charitable Foundation en JM Foundation. Wij danken de Universiteit van Californië San Diego Moores Cancer Center leden, Dr Jing Yang en Dr Kay T. Yeung voor het toestaan van ons het gebruik van hun microtoom en Randall Frans, Department of Surgery voor technische expertise.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
Referências
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
