Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari
Summary
Viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali primari umani costituiti da cellule epiteliali e stromali e che conservano le caratteristiche del tessuto endometriale nativo. Questo protocollo descrive i metodi dall’acquisizione del tessuto uterino all’elaborazione istologica degli organoidi endometriali.
Abstract
L’endometrio umano è uno dei tessuti più ormonali reattivi nel corpo ed è essenziale per l’istituzione della gravidanza. Questo tessuto può anche diventare malato e causare morbilità e persino la morte. I sistemi modello per studiare la biologia endometriale umana sono stati limitati a sistemi di coltura in vitro di tipo a cellula singola. Inoltre, le cellule epiteliali, uno dei principali tipi di cellule dell’endometrio, non si propagano bene o mantengono i loro tratti fisiologici nella coltura, e quindi la nostra comprensione della biologia endometriale rimane limitata. Abbiamo generato, per la prima volta, organoidi endometriali costituiti da cellule epiteliali e stromali dell’endometrio umano. Questi organoidi non richiedono materiali di impalcatura esogeni e specificamente organizzano in modo che le cellule epiteliali comprendano la struttura simile a uno sferoide e diventino polarizzate con cellule stromali al centro che producono e secernono collagene. I recettori dell’estrogeno, del progesterone e dell’androgeno sono espressi nelle cellule epiteliali e stromali e il trattamento con livelli fisiologici di estrogeni e testosterone promuovono l’organizzazione degli organoidi. Questo nuovo sistema modello può essere utilizzato per studiare la biologia endometriale normale e la malattia in modi che prima non erano possibili.
Introduction
L’endometrio umano allinea la cavità uterina e serve come primo contatto per l’embrione durante l’impianto. L’endometrio è composto da cellule epiteliali luminali e ghiandolari, fibroblasti stromali di supporto, cellule endoteliali e cellule immunitarie. Insieme, questi tipi di cellule costituiscono il tessuto endometriale che è uno dei tessuti più reattivi agli ormoni steroidei sessuali1. I cambiamenti che si verificano durante ogni ciclo mestruale sono sorprendenti. È necessaria un’adeguata crescita e rimodellamento dell’endometrio per consentire l’impianto dell’embrione. La risposta aberrante agli estrogeni e al progesterone può provocare un endometrio refrattario che non consente l’istituzione di una gravidanza di successo e può anche provocare malattie tra cui la neoplasia endometriale.
Al fine di studiare le risposte ormonali e i cambiamenti essenziali che si verificano nell’endometrio, le cellule dei tessuti endometriali eccitate dai pazienti durante l’intervento chirurgico o la biopsia endometriale sono state propagate nella coltura cellulare. Le cellule stromali endometriali proliferano preferibilmente e si propagano prontamente, e il processo di differenziazione indotto dal progesterone può essere ricapitolato in vitro. Di conseguenza, molto è stato appreso durante questo processo di differenziazione, definito deciduizzazione2,3. L’altro tipo di cellula principale nell’endometrio, le cellule epiteliali luminali e ghiandolare, tuttavia, non crescono così come i monostrati tradizionali, perdendo la polarità, diventando senescenti e con un limitato potenziale proliferare. Di conseguenza, meno è noto della loro biologia e del loro ruolo nell’endometrio umano. Poiché molti neoplasia provengono dalle cellule epiteliali, i meccanismi associati all’iperplasia o alla trasformazione nelle cellule tumorali rimangono da definire completamente. Inoltre, gli studi hanno stabilito che la risposta ormonale coinvolge le azioni paracrine intime tra le cellule epiteliali e stromali dell’endometrio4,5.
Recentemente, una coltura organoide tridimensionale (3D) di cellule epiteliali endometriali è stata stabilita da due gruppi indipendenti6,7, che sono i primi rapporti di organoidi formati dal tessuto endometriale. Questi organoidi erano costituiti da cellule epiteliali endometriali incorporate all’interno di una matrice proteica (Table of Materials) e non includevano un importante compartimento ormonale reattivo dell’endometrio endometriale, i fibroblasti stromali. Poiché le proteine della matrice possono variare da un lotto all’altro e possono innescare percorsi di segnalazione che non si verificano necessariamente nel tessuto, sarebbe ideale sostituire le proteine della matrice con componenti dell’endometrio. Nello studio attuale, viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali umani privi di scaffold di cellule epiteliali e stromali dell’endometrio umano. La presenza di cellule stromali non solo fornisce il supporto per le cellule epiteliali, ma fornisce anche le azioni paracrine necessarie che sono state stabilite per essere importanti per la risposta dell’ormone endometriale4,8,9 .
Il nuovo organoide endometriale multicellulare offre un sistema modello dell’endometrio che è semplice da generare e che incorpora cellule epiteliali e stromali. Questi organoidi possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti ormonali a lungo termine e i primi eventi di malattia come la tumorigenesi a causa di squilibri ormonali o insulti esogeni. La complessità di questi organoidi potrebbe infine essere ampliata per includere altri tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali e immunitarie con cellule potenzialmente miometriali per imitare veramente la fisiologia del tessuto umano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo generato organoidi endometriali umani composti da cellule epiteliali e stromali dell’endometrio senza l’uso di materiali scaffold esogeni. Mentre è già stato dimostrato che le cellule epiteliali endometriali primarie possono formare organoidi6,7, queste cellule sono state incorporate in una matrice gelatinosa di proteine secrete da cellule di sarcoma del topo (vedi Tabella dei materiali)per aiutare formano strutture simili a sferoidi. I…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione NIEHS/NIH/NCATS UG3 (ES029073) e dal fondo Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Vorremmo riconoscere lo strumento di patologia nordoccidentale per l’elaborazione degli organoidi fissi per l’incorporamento della paraffina. Vorremmo conoscere l’intero team UG3, compresi i laboratori Woodruff, Burdette e Urbanek, per le discussioni e le collaborazioni approfondite.
Materials
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |
Referências
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