多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成
Summary
上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。
Abstract
ヒト子宮内膜は、体内で最もホルモン応答性の組織の一つであり、妊娠の確立に不可欠です。この組織はまた、病気になり、罹患率、さらには死を引き起こす可能性があります。ヒト子宮内膜生物学を研究するモデルシステムは、単一細胞型のインビトロ培養系に限定されている。また、子宮内膜の主要な細胞型の一つである上皮細胞は、培養中に生理的形質をうまく伝播したり保持したりしないため、子宮内膜生物学に対する理解は限られています。ヒト子宮内膜の上皮細胞と間質細胞の両方からなる子宮内膜オルガノイドを初めて生成しました。これらのオルガノイドは、外因性足場材料を必要とせず、上皮細胞がスフェロイド様構造を包含し、コラーゲンを産生し分泌する中心の間質細胞と偏光するように特異的に組織化する。エストロゲン, プロゲステロンおよびアンドロゲン受容体は、上皮および間質細胞で発現され、エストロゲンとテストステロンの生理学的レベルで治療は、オルガノイドの組織を促進します.この新しいモデルシステムは、以前は不可能だった方法で正常な子宮内膜生物学と疾患を研究するために使用することができます。
Introduction
ヒト子宮内膜は子宮腔を直線し、移植中に胚の最初の接触として機能する。子宮内膜は、ルミナルおよび腺上皮細胞、支持性間質線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞から構成される。一緒に, これらの細胞タイプは、性ステロイドホルモン1に最も応答性の組織の一つである子宮内膜組織を構成します。.各月経周期の間に起こる変化は顕著です。子宮内膜の適切な成長および改造は、胚移植が起こることを可能にするために必要とされる。エストロゲンおよびプロゲステロンに対する異常な応答は、妊娠の確立を可能にしない難治性子宮内膜をもたらし、子宮内膜新生物を含む疾患をもたらす可能性さえある。
子宮内膜で起こるホルモン応答および本質的な変化を研究するために、手術中または子宮内膜生検中に患者から取り除かれた子宮内膜組織からの細胞は、細胞培養において伝播されている。子宮内膜間質細胞は、好ましく増殖し、容易に伝播し、プロゲステロンによって誘導される分化のプロセスは、インビトロで要約することができる。その結果、この分化プロセスの間に多くのことが学び、デシデュアル化2、3と呼ばれる。しかし、子宮内膜の他の主要な細胞型は、発光および腺上皮細胞は、従来の単層と同様に成長せず、極性を失い、老化し、増殖性が限られている。その結果、ヒト子宮内膜における生物学およびその役割についてはあまり知られていない。多くの新生物が上皮細胞に由来するにつれて、過形成または癌細胞への形質転換に関連するメカニズムは完全に定義されたままである。さらに、研究は、ホルモン応答が子宮内膜4、5の上皮細胞と間質細胞との間の親密なパラクリン作用を伴うことを確立した。
近年、子宮内膜上皮細胞の3次元(3D)オルガノイド培養が、子宮内膜組織から形成されたオルガノイドの最初の報告である2つの独立した基6,7によって確立された。これらのオルガノイドは、タンパク質マトリックス(材料の表)内に埋め込まれた子宮内膜上皮細胞から構成され、子宮内膜子宮内膜の重要なホルモン応答性コンパートメント、間質線維芽細胞を含んでいなかった。マトリックスタンパク質はロットごとに異なり、組織内で必ずしも発生しないシグナル伝達経路を引き起こす可能性があるため、マトリックスタンパク質を子宮内膜の成分に置き換えるのが理想的です。本研究では、ヒト子宮内膜の上皮細胞および間質細胞の足場のないヒト子宮内膜オルガノイドを生成するプロトコルが提示されている。間質細胞の存在は、上皮細胞の支持を提供するだけでなく、子宮内膜ホルモン応答4、8、9のために重要であることが確立された必要なパラクリン作用を提供する.
新しい多細胞子宮内膜オルガノイドは、生成が簡単で、上皮細胞と間質細胞の両方を組み込む子宮内膜のモデルシステムを提供します。これらのオルガノイドは、ホルモンの不均衡や外因性侮辱による腫瘍形成などの疾患の長期的なホルモン変化および初期の事象を研究するために使用することができる。これらのオルガノイドの複雑さは、最終的には、本当に人間の組織生理学を模倣するために、おそらくミオメトリオ細胞を持つ内皮および免疫細胞を含む他の細胞タイプを含むように拡張することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
外因性足場材料を用いずに子宮内膜の上皮細胞と間質細胞からなるヒト子宮内膜オルガノイドを生成した。原発性子宮内膜上皮細胞がオルガノイド6、7を形成できることが既に示されているが、これらの細胞はマウス肉腫細胞によって分泌されるタンパク質のゼラチン状マトリックスに埋め込まれた(材料の表を参照)。球状構造を形成?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、NIEHS/NIH/NCATS UG3助成金(ES029073)とノースウェスタンファインバーグ医学部ブリッジ基金(JJK)が資金提供を受けました。パラフィン埋め込みのための固定オルガノイドを処理するためのノースウェスタン病理学コア施設を認めたい。ウッドラフ、バーデット、アーバネックのラボを含むUG3チーム全体に対して、洞察に満ちたディスカッションとコラボレーションを行いたいと思います。
Materials
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |
Referências
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