多细胞人类原发性子宫内膜器官的生成
Summary
提出了一种产生人类原发子宫内膜器官的方案，该细胞由上皮细胞和基质细胞组成，并保留原生子宫内膜组织的特性。该协议描述了从子宫组织采集到子宫内膜器官组织处理的方法。
Abstract
人类子宫内膜是体内激素反应最灵敏的组织之一，对妊娠的建立至关重要。这种组织也可能生病，导致发病，甚至死亡。研究人类子宫内膜生物学的模型系统仅限于单细胞类型的体外培养系统。此外，上皮细胞是子宫内膜的主要细胞类型之一，在培养中不能很好地繁殖或保持其生理特性，因此我们对子宫内膜生物学的理解仍然有限。我们首次生成了由人类子宫内膜的上皮细胞和基质细胞组成的子宫内膜器官。这些有机体不需要任何外源性支架材料，并特别组织，使上皮细胞包含球形状结构，并变得极化与基质细胞在中心产生和分泌胶原蛋白。雌激素，黄体酮和雄激素受体在上皮和基质细胞中表达，用雌激素和睾丸激素的生理水平促进器官组织。这个新的模型系统可以用来研究正常的子宫内膜生物学和疾病的方式，以前是不可能的。
Introduction
人类子宫内膜线子宫腔，并作为胚胎在植入过程中的第一次接触。子宫内膜由发光和腺上皮细胞、支持性基质成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞组成。总之，这些细胞类型组成子宫内膜组织，这是对性类固醇激素1反应最灵敏的组织之一。每个月经周期发生的变化是惊人的。需要适当的生长和重塑子宫内膜，以允许胚胎植入发生。对雌激素和孕激素的异常反应可能导致难治性子宫内膜，不允许成功建立妊娠，甚至可能导致疾病，包括子宫内膜肿瘤。
为了研究子宫内膜的激素反应和基本变化，在手术或子宫内膜活检期间从患者身上切除的子宫内膜组织细胞在细胞培养中繁殖。子宫内质基质细胞优先增殖和繁殖，孕酮诱导的分化过程可在体外重述。因此，在这个分化过程中，人们学到了很多东西，称为二元化2，3。然而，子宫内膜中的另一个主要细胞类型，即发光和腺皮细胞，没有像传统的单层那样生长良好，失去极性，变得衰老，增殖潜力有限。因此，人们对于它们的生物学及其在人类子宫内膜中的作用知之甚少。由于许多肿瘤来自上皮细胞，与增生或癌细胞转化相关的机制仍有待完全定义。此外，研究已经证实，激素反应涉及子宫内膜4，5的上皮细胞和基质细胞之间的亲密对位细胞作用。
最近，由两个独立的组6，7建立了子宫内膜上皮细胞的三维（3D）有机体培养，这是首次报告由子宫内膜组织形成的器官。这些有机体由嵌入在蛋白质基质（材料表）内的子宫内膜上皮细胞组成，不包括子宫内膜内膜的重要激素反应室，即基质成纤维细胞。由于基质蛋白可能因批次而异，并可触发不一定在组织中出现的信号通路，因此，将基质蛋白替换为子宫内膜的成分是理想的选择。在目前的研究中，提出了一种产生无支架的人类子宫内膜器官的人类子宫内膜器官的表皮和基质细胞的协议。基质细胞的存在不仅为上皮细胞提供了支持，而且还提供了必要的副细胞作用，这些作用已被确定对子宫内膜激素反应4、8、9重要。.
新的多细胞子宫内膜器官提供了一个宫内膜的模型系统，易于生成，并结合上皮细胞和基质细胞。这些有机体可用于研究长期荷尔蒙变化和疾病的早期事件，如由于荷尔蒙失衡或外源性侮辱引起的肿瘤发生。这些器官的复杂性最终可以扩大，包括其他细胞类型，包括内皮细胞和免疫细胞与可能的骨髓细胞，以真正模仿人体组织生理学。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们产生了由内膜的上皮和基质细胞组成的人类子宫内膜器官，没有使用外源性支架材料。虽然已经表明，原子宫内膜上皮细胞可以形成器官6，7，这些细胞被嵌入在由小鼠肉瘤细胞分泌的蛋白质的胶质基质（见材料表），以帮助形成类球体状结构。此外，内膜基质细胞不存在。我们推测，我们系统中的基质细胞是子宫内膜组织的重要支持?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由NIEHS/NIH/NCATS UG3赠款（ES029073）和西北范伯格医学院桥梁基金（JJK）资助。我们要感谢西北病理学核心设施，用于处理石蜡嵌入的固定有机物。我们要感谢整个 UG3 团队，包括伍德拉夫、伯德特和厄本内克实验室，他们进行了富有洞察力的讨论和协作。
Materials
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |
Referências
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
