En protokoll for å generere menneskelige primære livmor organoids som består av epitel og stromal celler og beholde egenskapene til de innfødte livmor vevet er presentert. Denne protokollen beskriver metoder fra livmor vev oppkjøpet til histologic behandling av livmor organoids.
Den menneskelige endometrium er en av de mest hormonally responsive vev i kroppen og er avgjørende for etableringen av svangerskapet. Dette vevet kan også bli sykt og forårsake sykelighet og til og med død. Modellsystemer for å studere menneskets livmor biologi har vært begrenset til in vitro kultur systemer av enkelt celletyper. I tillegg epitelceller, en av de store celletyper av endometrium, ikke overføres godt eller beholde sine fysiologiske trekk i kultur, og dermed vår forståelse av livmor biologi fortsatt begrenset. Vi har generert, for første gang, livmor organoids som består av både epitel og stromal celler av den menneskelige endometrium. Disse organoids ikke krever noen eksogene stillas materialer og spesielt organisere slik at epitelceller omfatte spheroid struktur og bli polarisert med stromal celler i sentrum som produserer og skiller ut kollagen. Østrogen, progesteron og androgen reseptorer uttrykkes i epitel og stromal celler og behandling med fysiologiske nivåer av østrogen og testosteron fremme organiseringen av organoids. Denne nye modellen systemet kan brukes til å studere normal livmor biologi og sykdom på måter som ikke var mulig før.
Den menneskelige endometrium linjene livmorhulen og fungerer som den første kontakten for fosteret under implantation. Endometrium består av luminal og kjertel epitelceller, støttende stromal fibroblaster, endothelial celler og immunceller. Sammen, disse celletyper utgjør livmor vevet som er en av de mest responsive vev til sex steroid hormoner1. Endringene som skjer under hver menstruasjonssyklus er slående. Hensiktsmessig vekst og ombygging av endometrium er nødvendig for å muliggjøre embryo implantation å forekomme. Avvikende respons på østrogen og progesteron kan resultere i en ildfast endometrium som ikke tillater for vellykket etablering av graviditet og kan også føre til sykdommer, inkludert livmor neoplasi.
For å studere hormon responsen og vesentlige endringer som oppstår i endometrium, celler fra livmor vev excised fra pasienter under kirurgi eller livmor biopsi har blitt spredd i cellekultur. Livmor stromal celler fortrinnsvis sprer og spres lett, og prosessen med differensiering indusert av progesteron kan være sammenfattet in vitro. Som et resultat, har mye blitt lært i løpet av denne differensiering prosessen, kalt decidualization2,3. Den andre store celletypen i endometrium, luminal og kjertel epitelceller, men ikke vokser vel som tradisjonelle monolagere, mister polaritet, blir senescent, og har begrenset proliferativ potensial. Som et resultat, er mindre kjent av deres biologi og deres rolle i den menneskelige endometrium. Ettersom mange neoplasi stammer fra epitelcellene, er mekanismer forbundet med prostatahyperplasi eller transformasjon til kreftceller fortsatt å være fullt definert. Videre har studier fastslått at hormon responsen innebærer intime paracrine handlinger mellom epitel og stromal celler i endometrium4,5.
Nylig, en tredimensjonal (3D) organoid kultur av livmor epitelceller ble etablert av to uavhengige grupper6,7, som er de første rapportene av organoids dannet av livmor vev. Disse organoids var sammensatt av livmor epitelceller innebygd i et protein matrise (tabell over materialer) og ikke inkludere en viktig hormonally responsive kupé av livmor endometrium, den stromal fibroblaster. Som matrisen proteiner kan variere fra mye til mye og kan utløse signalering trasé som ikke nødvendigvis forekommer i vevet, ville det være ideelt å erstatte matrisen proteiner med komponenter av endometrium. I dagens studie, en protokoll for å generere stillas frie menneskelige livmor organoids av epitel og stromal celler av den menneskelige endometrium presenteres. Tilstedeværelsen av stromal celler ikke bare gir støtte for epitelceller, men gir også de nødvendige paracrine handlinger som er etablert for å være viktig for livmor hormon respons4,8,9 .
Den nye flercellede livmor organoid tilbyr en modell system av endometrium som er enkel å generere og som inkorporerer både epitel og stromal celler. Disse organoids kan brukes til å studere langsiktige hormonelle forandringer og tidlige hendelser av sykdom som tumorigenesis på grunn av hormonell ubalanse eller eksogene fornærmelser. Kompleksiteten i disse organoids kan etterhvert utvides til å omfatte andre celletyper, inkludert endothelial og immunceller med muligens myometrielle celler for å virkelig etterligne menneskelig vev fysiologi.
Vi har generert menneskelige livmor organoids består av epitel og stromal celler i endometrium uten bruk av eksogene stillas materialer. Mens det allerede er vist at primære livmor epitelceller kandanne organoids,var disse cellene innebygd i en geléaktige matrise av proteiner utskilles av mus sarkom celler (se tabell over materialer) for å hjelpe form spheroid strukturer. I tillegg var livmor stromal celler fraværende. Vi spekulerer i at de …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) og Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Vi ønsker å anerkjenne den nordvestlige patologi kjerne anlegg for behandling av faste organoids for para fin innebygging. Vi vil gjerne erkjenne hele UG3 team inkludert Woodruff, Burdette, og Urbanek Labs for innsiktsfulle diskusjoner og samarbeid.
Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
Dispase | Corning | 354235 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |