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Biochemistry

सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली और सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण के लिए क्रायोतैयारी पर सेल कल्चर

Published: December 10, 2019 doi: 10.3791/60461
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2, 1,2
1Inserm, UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), Université Grenoble Alpes, 2ID16A Beamline, ESRF, The European Synchrotron

Summary

यहां प्रस्तुत सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली पर सेल संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल है और एक्स-रे फ्लोरेसेंस इमेजिंग से पहले एक सिंक्रोट्रॉन क्रायोजेनिक एक्स-रे नैनोप्रोब के साथ डुबकी-फ्रीजिंग है। जब केवल कमरे का तापमान नैनो विश्लेषण प्रदान किया जाता है, जमे हुए नमूनों को और अधिक फ्रीज-सूखे किया जा सकता है । ये इंट्रासेलर मौलिक संरचना के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं।

Abstract

उपकोशिकीय स्तर पर धातु आयनों के वितरण के बारे में बहुत कम जाना जाता है। हालांकि, उन रासायनिक तत्वों में आवश्यक नियामक कार्य होते हैं और उनके अशांत होडोस्टोसिस विभिन्न रोगों में शामिल होते हैं। अत्याधुनिक सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनोप्रोब्स दो आयामी (2डी) और त्रि-आयामी (3 डी) वितरण और पूरे कोशिकाओं के अंदर धातुओं की एकाग्रता को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं ऑर्गेनेल लेवल। यह कोशिका के फिजियोपैथोलॉजी में धातुओं की भूमिका पर जांच के नए रोमांचक वैज्ञानिक क्षेत्रों को खोलता है। सेलुलर तैयारी विशेष रूप से बुनियादी विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण और अक्सर जटिल प्रक्रिया है। यद्यपि एक्स-रे फ्लोरेसेंस तकनीक अब व्यापक हैं और विभिन्न तैयारी विधियों का उपयोग किया गया है, बहुत कम अध्ययनों ने कोशिकाओं की मौलिक सामग्री के संरक्षण की जांच की है, और क्रायोतैयारी के लिए कोई चरणवार विस्तृत प्रोटोकॉल नहीं है एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनोप्रोब्स के लिए अनुयायी कोशिकाएं अब तक जारी की गई हैं । यह एक प्रोटोकॉल का वर्णन है जो तेजी से क्रायोफिक्शन के लिए स्टेपवाइज सेलुलर तैयारी प्रदान करता है ताकि क्रायोजेनिक वातावरण और हस्तांतरण उपलब्ध होने पर जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में कोशिकाओं के सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण को सक्षम किया जा सके। यदि नैनो विश्लेषण कमरे के तापमान पर किया जाना है, तो क्रायोफिक्स्ड अनुयायी सेलुलर तैयारी को फ्रीज-सुखाने के लिए एक अतिरिक्त प्रक्रिया प्रदान की जाती है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पिछले कार्यों में इस्तेमाल किया गया है, सबसे हाल ही में स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एक ऑर्गेनोमेटलिक यौगिक के 2 डी और 3 डी इंट्रासेलुलर वितरण का अध्ययन करने में ।

Introduction

नए डिजाइन किए गए सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस (एसआर-एक्सआरएफ) नैनोप्रोब्स पूरी तरह से मात्रात्मक तरीके से तत्वों के उपकोशिकीय वितरण के दृश्य की अनुमति देते हैं। एक उदाहरण के रूप में, यह विश्लेषणात्मक क्षमता नैनोकणों1 या ऑर्गेनोमेटलिक अणुओं जैसे ओस्मियम आधारित परिसरों2के तेज की जांच की अनुमति देती है, जो शक्तिशाली कैंसर रोधी गुणों के साथ धातु आधारित अणुओं के इंट्रासेलुलर तेज में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। एक बहुतत्व तकनीक के रूप में, नैनोप्रोब के साथ एसआर-एक्सआरएफ3 फास्फोरस, सल्फर, पोटेशियम, कैल्शियम, लोहा, तांबा और जस्ता सहित इंट्रासेलुलर सबसे जैविक रूप से महत्वपूर्ण तत्वों की मात्रा और स्थानीयकरण करने का एक तरीका प्रदान करता है। दरअसल, हार्ड एक्स-रे का उपयोग लेबल-मुक्त फैशन में पूरे जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं को छवि के लिए बड़ी प्रवेश गहराई प्रदान करता है। इसके अलावा, ब्याज के अधिकांश तत्वों के कश्मीर-किनारे तक पहुंच प्रदान करना, एक्स-रे फ्लोरेसेंस सबसे कुशलता से उत्साहित है। क्रायोजेनिक दृष्टिकोणों का उपयोग विकिरण क्षति को कम करने और कोशिका संरचना और मौलिक वितरण के संरक्षण के अनुकूलन की अनुमति देता है।

कोशिकाओं में धातुओं का अध्ययन करने के लिए अधिकांश उपलब्ध स्थानिक रूप से हल विश्लेषणात्मक तकनीकें सतह तकनीक हैं जिन्हें उत्पादित करने के लिए कोशिकाओं के बहुत पतले और सपाट वर्गों की आवश्यकता होती है। इसमें मुख्य रूप से ऊर्जा-फैलाव एक्स-रे विश्लेषण (स्टेम-ईडीएक्स), ऊर्जा-फ़िल्टर किए गए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएफ-टेम), और नैनोस्केल सेकेंडरी आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नैनोसिम) के साथ स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल है। बाद जमे हुए, हाइड्रेटेड सेल वर्गों पर प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है, जबकि क्रायो विश्लेषण नायाब स्थानिक संकल्प लेकिन गरीब मौलिक संवेदनशीलता के साथ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ किया जा सकता है । कण-प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (PIXE) ने पूरी कोशिकाओं में मौलिक वितरण के अध्ययन की अनुमति दी है। यह माइक्रोन पैमाने पर एक निष्पक्ष मौलिक संवेदनशीलता के साथ पूरी तरह से मात्रात्मक होने का लाभ है और यहां तक कि उपसूक्ष्म संकल्प4पर, लेकिन विकिरण क्षति और क्रायोजेनिक क्षमताओं की कमी से ग्रस्त है जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए । ये सभी विश्लेषणात्मक तकनीक कोशिकाओं की मौलिक इमेजिंग में एक-दूसरे के पूरक हैं, लेकिन सभी तकनीकों के लिए नमूना तैयारी प्रक्रिया एक महत्वपूर्ण कदम है। सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए संभावित संदूषण के साथ-साथ मौलिक पुनर्वितरण और/या रिसाव को सीमित करने के लिए इसे सरल रखा जाना चाहिए । जैसा कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में प्रदर्शित किया गया है, एक क्रायोजेनिक कार्यप्रवाह, जिसमें कोशिका का क्रायो-इम्मोबिलाइजेशन और क्रायोस्कैनिंग चरण में क्रायोट्रांसफर शामिल है, मूल राज्य5,6,7,8,9,10के करीब उपकोशिकीय स्तरों पर इष्टतम मौलिक संरक्षण की अनुमति देता है। इस समझ को 2डी या 3 डी में पूरे जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चरल इमेजिंग का उत्पादन करने के लिए सिंक्रोट्रॉन क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे माइक्रोस्कोपी (जैसे, पूर्ण क्षेत्र माइक्रोस्कोप और स्कैनिंग माइक्रोस्कोप) के विकास में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। लॉरेंस बर्कले नेशनल लेबोरेटरी12में एडवांस्ड लाइट सोर्स के बीमलाइन 2.1 (एक्सएम-2) में सॉफ्ट एक्स-रे माइक्रोस्कोप के लिए विभिन्न क्रायोजेनिक वर्कफ्लो11 विकसित किए गए थे, जो इलेक्ट्रॉन स्टोरेज रिंग बेसी द्वितीय (जर्मनी)13,अल्बा लाइट सोर्स (स्पेन)14के बीमलाइन मिस्ट्राल और डायमंड लाइट सोर्स15अन्य के बीमलाइन B24 में एक्स-रे माइक्रोप्रोब्स16,17का उपयोग करके इंट्रासेलर मौलिक विश्लेषण के लिए हाल ही में इसी तरह के कार्यप्रवाह को सबसे विश्वसनीय तैयारी और संरक्षण विधि दिखाई गई थी।

हालांकि एक्स-रे नैनोप्रोब तकनीकों को व्यापक रूप से सेलुलर मौलिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना शुरू कर रहे हैं, विशेष रूप से क्रायोजेनिक एसआर-XRF क्षमताओं के आगमन के साथ, अनुसंधान समुदाय के लिए अब तक कोई स्टेपवाइज प्रोटोकॉल का प्रसार नहीं किया गया है । यहां, क्रायोजेनिक परिस्थितियों में विश्लेषण किए जाने वाले सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली पर मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत क्रायोफिक्स्ड अनुयायी कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान की जाती है। यदि एक्स-रे विश्लेषण कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए तो प्रोटोकॉल के बाद लागू किया जाने वाला एक फ्रीज-सुखाने वाला कदम भी प्रदान किया जाता है। जबकि प्रस्तावित प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं एमडी-एमबी-2312 के साथ उपयोग किया गया है और फ्रीज-सुखाने का प्रदर्शन माउस न्यूरॉन्स18,20,21पर अन्य लोगों के बीच किया गया था, इसे विभिन्न प्रकार की मानव या पशु कोशिकाओं तक आसानी से बढ़ाया जा सकता है।

Protocol

सीईए के जीवन विज्ञान प्रभाग (सीईटीएआई, A14-006) की पशु देखभाल समिति द्वारा प्रायोगिक प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी । वे फ्रांसीसी कानून और 24 नवंबर १९८६ (86/609/EEC) के यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश के अनुपालन में आयोजित किए गए थे ।

1. सिलिकॉन नाइट्राइड (एसआई3एन4)झिल्ली समर्थन तैयारी

नोट: क्योंकि झिल्ली नाजुक और नाजुक है, इसके समर्थन (२०० μm मोटी सिलिकॉन फ्रेम) को धीरे से संभाला जाना है, आदर्श रूप में एक पतली कार्बन चिमटी या डुमोंट चिमटी #5, सीधे आत्म बंद ठीक सुझावों के साथ । इस प्रोटोकॉल में 5 मिमी x 5 मिमी के फ्रेम और 1.5 मिमी x 1.5 मिमी की झिल्ली आकार के साथ सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली का उपयोग किया गया। प्रयोग शुरू करने से पहले झिल्ली को लगभग 12 घंटे (यानी सेल सीडिंग) तैयार किया जाना चाहिए। झिल्ली को दिन के अंत में तैयार किया जा सकता है और कक्षा II लैमिनार प्रवाह हुड के तहत रात भर सूखने छोड़ दिया जाता है ताकि वे अगली सुबह का उपयोग करने के लिए तैयार हों। सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियां बेचने वाली ज्यादातर कंपनियों के लिए 200 माइक्रोन की सिलिकॉन फ्रेम मोटाई मानक है। यदि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला उत्पाद उपलब्ध नहीं है, तो 0.5−1.5 मिमी की सीमा में झिल्ली आकार का उपयोग 5 मिमी x 5 मिमी के मानक फ्रेम आकार के साथ किया जा सकता है। जब एक्स-रे टोमोग्राफी का उपयोग किया जाएगा तो बड़ी झिल्ली आकार को पसंद किया जाता है। टेम ग्रिड टाइप सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियां 0.5 मिमी के झिल्ली आकार के साथ और 50 एनएम की मोटाई का भी उपयोग किया जा सकता है।

  1. एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन(चित्रा 1)युक्त कैप्सूल खोलें। समर्थन को हल्के से ढीला करने के लिए कैप्सूल को धीरे से निचोड़ें।
  2. पतली चिमटी का उपयोग कर सिलिकॉन फ्रेम के कोनों में से एक पकड़ो। ध्यान रखें कि केंद्र में एसआई3एन4 झिल्ली को न छुएं। 200 या 500 एनएम मोटी झिल्ली आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकती है।
  3. पतली चिमटी का उपयोग करना, धीरे से एक बाँझ ग्लास पेट्री डिश में एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन जगह, सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़की की सपाट सतह का सामना करना पड़ रहा है (यानी, पकवान के नीचे का सामना करना पड़ गुहा) ।
  4. पेट्री डिश के ढक्कन को हटा दें और लैमिनार फ्लो कैबिनेट के तहत 25−30 मिन के लिए यूवी लाइट के नीचे झिल्ली छोड़ दें।
    नोट: यूवीसी लाइट (२५४ एनएम) आम तौर पर २०० μW/सेमी2पर सेट है ।
  5. झिल्ली पर पॉली-एल-लिसिन के 10 माइक्रोन डाल दें। ड्रॉप एसआई3एन4 झिल्ली को अच्छी तरह से कवर करना चाहिए और सिलिकॉन फ्रेम पर थोड़ा फैल सकता है। मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 25 मिन के लिए इसे 100% सापेक्ष आर्द्रता और 95% हवा, 5% सीओ2पर 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    नोट: इस मामले में एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं के लिए एक पॉली-एल-लिसिन कोटिंग का उपयोग किया गया था। सेल लाइन के प्रकार के आधार पर, विभिन्न कोटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है, और इस चरण को तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  6. बाँझ 48 अच्छी प्लेट में, 0.22 माइक्रोन बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किए गए अल्ट्रा-प्योर और अल्ट्रा-ट्रेस पानी के 200−250 माइक्रोन के साथ विभिन्न कुओं को भरें। आमतौर पर, प्रत्येक कुएं का उपयोग 2−3 झिल्ली तक कुल्ला करने के लिए किया जा सकता है। ठीक चिमटी का उपयोग करना, अपने सिलिकॉन फ्रेम के एक कोने में झिल्ली समर्थन उठाओ । झिल्ली को लगातार तीन कुओं में खड़ी 10 एस जलमग्न करके धीरे से कुल्ला करें।
    नोट: झिल्ली का समर्थन इनक्यूबेटर से बाहर ले जाया जाता है और कमरे के तापमान पर संसाधित किया जा सकता है, तापमान और आर्द्रता के साथ एक वर्ग द्वितीय laminar प्रवाह हुड द्वारा परिभाषित किया गया है ।
  7. झिल्ली एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली के एक खाली कुएं में खड़ी समर्थन रखो, इसे कवर, और यह एक वर्ग द्वितीय laminar प्रवाह हुड के तहत रात भर सूखी।

2. सेल सीडिंग

  1. एक बाँझ 4 अच्छी तरह से थाली में, झिल्ली को अपने फ्लैट साइड के साथ ऊपररखें।
  2. एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को पीएचईईएम में एक मोनोलेयर संस्कृति में फेनोल रेड/ग्लूटामैक्स I के साथ रखा जाता है, जो 5% सीओ2 एयर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण बछड़े सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है।
  3. जब कोशिकाएं 60−70% तक पहुंचती हैं तो मीडिया को डिश या फ्लास्क से हटा दें।
  4. 1x को 10 मिलीलीटर डल्बेकको के फॉस्फेट बफरेड लवलाइन के साथ सीए2 + या एमजी2 +के बिना धोलें।
  5. 0.05% ट्राइप्सिन/ईटीए समाधान के 3 mL/T75 फ्लास्क जोड़ें और सुनिश्चित करें कि पूरे मोनोलेयर ट्राइप्सिन समाधान के साथ कवर किया गया है।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3−5 मिन के लिए इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं को अलग करना शुरू कर देते हैं। देखभाल के लिए अधिक नहीं लिया जाना चाहिए कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज नहीं है और कोशिकाओं को समय से पहले अलग करने के लिए मजबूर नहीं है ।
  7. 10% भ्रूण बछड़े सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन या पूर्ण मीडिया के साथ पूरक डीएमईएम के 8 मिलीलीटर जोड़ें और पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। मीडिया में सीरम ट्राइप्सिन को बेअसर कर देगा।
  8. कमरे के तापमान पर 3 न्यूनतम के लिए 250 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें। अलौकिक Aspirate।
  9. सेल पैलेट युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में 8 मिलीलीटर ताजा पूर्ण मीडिया जोड़ें, और कोशिकाओं को एक ही सेल निलंबन में तितर-बितर होने तक कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  10. पूर्ण मीडिया में प्रति मिलीएम 5 x 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करकोशिकाओं की गणना करें और 5 x 106 कोशिकाओं को पतला करें (200 मीटर एल-अल्नाइल-एल-ग्लूटामाइन डिपेप्टाइड के साथ डीएमईएम 0.85% नासीएल समाधान 10% भ्रूण सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेक्टोरेपिसिन के साथ पूरक)।
  11. एमडीए-एमबी-231 सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन लें और झिल्ली पर जमा करें। यह एमडीए-एमबी-231 के लिए 50,000 कोशिकाओं/10 माइक्रोन से मेल खाती है। ड्रॉप एसआई3एन4 झिल्ली को अच्छी तरह से कवर करना चाहिए और सिलिकॉन फ्रेम पर थोड़ा सा फैल सकता है। माइक्रोपाइपेट की नोक के साथ एसआई3एन4 झिल्ली को न छूने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
    नोट: सेल लाइन और प्रयोगों या माप के प्रकार के आधार पर, सेल घनत्व भिन्न हो सकता है और तदनुसार परीक्षण किया जाना चाहिए। यहां एसआई3एन4 झिल्ली को बोने के लिए प्रस्तावित सेल घनत्व प्रायोगिक परिस्थितियों के लिए इष्टतम पाया गया और एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं2के आगे एसआर-एक्सआरएफ नैनो-विश्लेषण किया गया।
  12. हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स (एचएन) के लिए, भ्रूण दिवस 18.5 चूहों से हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क ऊतक को हटा दें और इसे हेप्स-एचबीएस (5.3 m KCl) में 0.25% ट्राइप्सिन में पचाएं, 0.44 एमएम एचएएच2पीओ4,137.9 एमएम एनएसीएल, 0.34 एमएम एनएएच2पीओ4,5.56 एमएम ग्लूकोज) 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 min18,19.
  13. एक P1000 टिप और एक P200 टिप के साथ एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, ड्राइंग और पिपेट के साथ शंकु सामग्री कई बार जारी करके यांत्रिक वियोजन प्रदर्शन करते हैं । इस चरण के दौरान, सावधान रहें कि माध्यम में हवा के बुलबुले न बनाएं, क्योंकि हवा के बुलबुले न्यूरॉन्स के लिए जहरीले हैं।
  14. कुछ मिनट रुको जब तक कुल ट्यूब के तल पर सुलझेगी ।
  15. बिखरे हुए कोशिकाओं वाले अधिनेत को बाँझ एपपेनडोर्फ ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुल मिलाकर संस्कृति माध्यम के ~ 25 μl छोड़ दें।
  16. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके विसोशिएट कोशिकाओं की गणना करें। इक्का-दुक्का एचएन न्यूरॉन्स को 7 x 104 कोशिकाओं सेमी-2 पर पॉली-एल-लाइन (1 मिलीग्राम/एमएल पॉली-एल-लाइन) -लेपित सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली की एकाग्रता पर चढ़ाया जाता है।
  17. केवल एचएन के साथ झिल्ली के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक पहले डीएमईएम में न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें। डीएमईएम में एचएन चढ़ाना के बाद एक एच, माध्यम को न्यूरोबेसल प्लेटिंग मीडिया (0.85% नैल समाधान में 200 एमएम एल-अल्नाइल-एल-ग्लूटामाइन डिपेप्टाइड में बदल दिया जाता है, और बी 27 पूरक डी = 1/50 न्यूरोबेसल में पतला)18,19।
  18. एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए 25 मिन के लिए इनक्यूबेटर (100% सापेक्ष आर्द्रता, 95% हवा और 5% सीओ2)में झिल्ली को 37 डिग्री सेल्सियस पर सपोर्ट करें। यह कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और सब्सट्रेट से जुड़ना शुरू करने की अनुमति देता है। उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के आधार पर इसे अनुकूलित किया जा सकता है।
  19. आवश्यक पूर्ण संस्कृति माध्यम का 1 mL जोड़ें (200 एमएम एल-अल्नाइल-एल-ग्लूटामाइन डिपेप्टाइड के फिनॉल रेड के साथ डीएमईएम 0.85% नासीएल समाधान में 10% भ्रूण बछड़े के साथ पूरक एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में प्लास्टिक की दीवार के खिलाफ पिपेट टिप डालकर और झिल्ली को कवर करते समय माध्यम को बहुत धीरे-धीरे जारी करके 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) ।
  20. एसआई3एन4 झिल्ली(चित्रा 2)के कुएं गुहा में फंसे किसी भी हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए 4 अच्छी प्लेट की दीवार के खिलाफ झिल्ली ऊर्ध्वाधर रखें। ऐसा करने के लिए, ठीक चिमटी का उपयोग करें और बुलबुले को बहुत धीरे से धक्का दें, झिल्ली को छूने और नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए एसआई3एन4 बैकसाइड फ्रेम के समानांतर आगे बढ़ें।
  21. झिल्ली को अच्छी तरह से नीचे क्षैतिज रूप से वापस रखें और उपयोग की जाने वाली सेल लाइन की वृद्धि दर के आधार पर आवश्यक समय के लिए 4 अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेटर में छोड़ दें। एमडीए-एमबी-231 प्रकोष्ठों को रातोंरात इनक्यूबेटेड किया गया।

3. उपचार या मध्यम परिवर्तन

  1. 4 अच्छी प्लेट से माध्यम निकालें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस समाधान के 1 mL के साथ एक बार कुल्ला। पीबीएस को त्यागें और 1 मिलील पिपेट टिप का उपयोग करके वांछित उपचार के उपस्थिति या अनुपस्थिति (नियंत्रण) में गर्म पूर्ण ताजे माध्यम का 1 मिलील जोड़ें, अच्छी प्लेट की दीवार के खिलाफ तरल को बहुत धीरे-धीरे जारी करें। एसआई3एन4 झिल्ली को झिल्ली गति या उठाने से बचने के लिए बिना किसी गड़बड़ी के धीरे-धीरे जलमग्न किया जाना चाहिए।

4. क्रायो-डुबकी-फ्रीजिंग द्वारा सेलुलर तैयारी का स्थिरीकरण

नोट: आवश्यक ऊष्मायन समय के अंत में, उपचार की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक धोया और क्रायोफिक्स्ड करना होगा। डुबकी-फ्रीजिंग, पहले सेट-अप और स्वचालित डुबकी फ्रीजर मशीन को ठंडा करने से पहले सेलुलर तैयारी को कुल्ला और दाग शुरू करने से पहले लगभग 30 मिनट। जैसा कि आप क्रायोजेन्स में हेरफेर करते हैं, उपयुक्त क्रायोजेनिक दस्ताने, सुरक्षा चश्मा, बंद जूते और प्रयोगशाला कोट के उपयोग की आवश्यकता होती है। तरल नाइट्रोजन को उपयुक्त देवरों में ले जाया जाना चाहिए, और कार्य स्थल को ऑक्सीजन मॉनिटर की उपस्थिति के साथ पर्याप्त रूप से हवादार किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, 20−30% का कम हाइग्रोमेट्री स्तर सामग्री, देवरस और क्रायोजेन्स के बर्फ संदूषण को सीमित करने में मदद करता है, जो नमूनों के विट्रीफिकेशन के लिए हानिकारक है (यानी, एक असंगत बर्फ की परत)। आदर्श रूप से, शोधकर्ता के अनुभव स्तर के आधार पर, एक सत्र के लिए 10−12 नमूने विट्रीफिकेशन के लिए एक ही माध्यमिक क्रायोजेन तरल एथेन कप का उपयोग करके तैयार किए जा सकते हैं। सत्रों के बीच, स्वचालित डुबकी फ्रीजर एक 1 घंटे स्वचालित सेंकना बाहर प्रक्रिया की आवश्यकता है । आदर्श रूप से, नमूनों को समान ऊष्मायन स्थितियों के साथ संसाधित किया जाना चाहिए। फिर भी, नियंत्रण पहले संसाधित किया जा सकता है, एक विशेष उपचार की स्थिति के साथ नमूनों के बाद ।

नोट: डुबकी-ठंड के लिए निम्नलिखित कदम एमडीए-एमबी-231 या एचएन कोशिकाओं दोनों पर लागू होते हैं।

  1. कोशिकाओं के तेजी से क्रायोफिक्शन के लिए क्रायोप्लर की स्थापना करें।
    1. स्वचालित डुबकी फ्रीजर चालू करें।
    2. पैरामीटर (जैसे, तापमान, प्रतिशत आर्द्रता, ब्लॉटिंग समय दर्ज करें यदि स्वचालित ब्लॉटिंग का उपयोग किया जाता है, और नमूने को क्रायोजेनिक कंटेनर में स्थानांतरित करने की सुविधा प्रदान करने के लिए क्रायोजेन की सतह पर ले जाने की स्थिति) सीधे कंसोल और मापदंडों से सेटिंग्स मेनू। मौजूदा मामले में आर्द्रता कक्ष के मापदंडों में 37 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता 80 फीसद तय की गई थी।
      नोट: इस प्रोटोकॉल और एक्स-रे इमेजिंग के लिए त्वरित और सावधान मैनुअल ब्लॉटिंग के साथ बेहतर विट्रीफिकेशन परिणाम प्राप्त किए गए थे। इस प्रकार, प्रोटोकॉल स्वचालित ब्लॉटिंग अनुक्रम कार्यक्रम का उपयोग नहीं करता है।
    3. ह्यूमिडिफायर चैंबर को संलग्न करें और आर्द्रता को संरक्षित करने के लिए पहले इसे डबल-आसुत पानी के 60 मिलील के साथ सिरिंज का उपयोग करके भरें, और फिर स्वचालित डुबकी फ्रीजर कंसोल पर 20 मिलील के रूप में बुलाया गया है।
      नोट: अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करने से बचें क्योंकि यह वाष्पीकरण प्रणाली को नुकसान पहुंचा सकता है। वाल्व बंद करें और ह्यूमिडिफायर की पीठ पर संलग्न ट्यूबिंग छोड़ दें।
    4. अपने धारक में काले एथेन कप स्थापित करें और इसे प्लास्टिक की टोपियों से कवर करें।
    5. कोल्ड चैंबर के देवर को एलएन2से भरें, इसे कार्य क्षेत्र के भीतर ग्रिड के स्तर पर लाया जाए।
    6. ईएम-जीपी कार्य क्षेत्र में समर्पित स्थान में आयोजित स्थानांतरण कंटेनर में क्रायोफोक्सेशन के बाद झिल्ली को स्टोर करने के लिए एक समर्पित क्रायो-बॉक्स रखें और एथेन कप धारक के करीब।
      नोट: समर्पित क्रायो-बॉक्स ग्रेनोबल में यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण के नैनोप्रोब बीमलाइन ID16A में एक इन-हाउस विकास है। विनिर्देशों के साथ चित्र अनुरोध पर उपलब्ध हैं(चित्र 3)। वे एक LN2 देवर में दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक ५० मीटर शंकुन ट्यूब में एक समय में चार संग्रहीत किया जा सकता है । एक वैकल्पिक संभावना में एक एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन स्टोर करने के लिए गुंबद टोपियां के साथ एक छोटे से 0.2 मिलीएल नियमित पीसीआर पतली दीवार ट्यूब का उपयोग करने में शामिल है। एलएन2 को ट्यूब भरने की अनुमति देने के लिए आपको गर्म सिरिंज सुई का उपयोग करके दीवार ट्यूब के शीर्ष भाग में ~ 2 मिमी छेद ड्रिल करने की आवश्यकता होगी।
    7. एलएन2 के साथ स्थानांतरण कंटेनर भरें और इसे समर्पित एल्यूमीनियम ढक्कन के साथ कवर करें। एलएन2 (आमतौर पर ~ 2 एल की आवश्यकता है) के साथ ठंडे कक्ष को भरने के लिए जारी रखें 100% पर रखते हुए एलएन2 स्तर पर नज़र रखें कंसोल पर प्रदर्शन। अंतिम आवश्यक तापमान तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें।
    8. प्लास्टिक की टोपी निकालें और एथेन बोतल से जुड़े तरलता के साथ एथेन कप को कवर करें। तापमान सेटपॉइंट तक एथेन कप का तापमान बराबर ी तक इंतजार करें। पहुंचने पर, माध्यमिक क्रायोजेन (यानी, द्रवित इथेन) का उपयोग करना शुरू करें।
      नोट: उपयोग किया गया सेटपॉइंट -180 डिग्री सेल्सियस था, जो इथेन पिघलने बिंदु (-182.8 डिग्री सेल्सियस) से थोड़ा ऊपर था। आपको एथेन लिक्वेफायर को प्रीकूल करने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि यह एथेन कप के ठंढ गठन और संदूषण का स्रोत हो सकता है।
    9. उच्च शुद्धता इथेन बोतल मुख्य वाल्व खोलें और बहुत धीरे-धीरे दबाव नियामक खोलें जब तक कि आपको इथेन का धीमा कोहरा न मिल जाए। जब तक तरल एथेन नहीं बनाता तब तक यह बहुत कम प्रवाह रखें। कप को अपने शीर्ष किनारे पर भरें। दबाव नियामक और इथेन की बोतल के मुख्य वाल्व को बंद करें। लीका तरलको ध्यान से निकालें और इसे धुएं के हुड के नीचे एक छोटे पॉलीस्टीरिन समर्थन पर अलग छोड़ दें। कार्य क्षेत्र और एथेन कंटेनर के ठंढ संदूषण को रोकने के लिए मशीन के साथ प्रदान की गई काले पॉलीस्टीरिन कैप के साथ कार्य क्षेत्र को शिथिल रूप से कवर रखें।
    10. नमूने के मैनुअल ब्लॉटिंग से ठीक पहले, ब्लैक पॉलीस्टीरिन कैप और कंसोल प्रेस"लोअर चैंबर"के मेनू से हटा दें, जो क्रायोजेनिक कार्य क्षेत्र के संपर्क में पर्यावरण कक्ष लाता है।
  2. नमूना दाग करने के लिए तैयार करें।
    1. संस्कृति माध्यम से लवण के निशान हटाने के लिए पर्याप्त बफर तैयार करें। इस प्रोटोकॉल के लिए एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को खंगालने के लिए अमोनियम एसीटेट बफर का इस्तेमाल किया गया था।
      नोट: अमोनियम एसीटेट बफर अधिकांश सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त है, और यह एक्स-रे फ्लोरेसेंस सिग्नल (जेड और जीटी; 9 के साथ तत्वों पर विचार) में नहीं जोड़ता है। न्यूरोनल कोशिकाओं जैसे कुछ विशेष सेल लाइनों को समर्पित बफर के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के लिए, एक खारा समाधान जिसमें 0.5 एम एनए2एचएमओ4 की 1.8 मात्रा और 0.5 एम एनएएच2पीओ4 की 1.9 मात्रा का उपयोग किया जा सकता है15। दूसरी ओर, बफर में निहित फास्फोरस या क्लोरीन एक्सआरएफ स्पेक्ट्रम में योगदान देगा। नकली एक्स-रे उत्सर्जन लाइनों की इस सीमा को ध्यान में रखना चाहिए ब्याज के तत्वों के आधार पर पता लगाया जाना चाहिए ।
    2. अमोनियम एसीटेट अल्ट्राप्योर सॉल्यूशन से 150 एमएम अमोनियम एसीटेट सॉल्यूशन तैयार करें और पीएच (7.0-7.3) और ऑस्मोलिसिटी (270-300 mOsm/kg) की जांच करें
      नोट: उपरोक्त ओस्मोलैरिटी कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना डुल्बेकको के फॉस्फेट बफर लवइन (डी-पीबीएस) के बराबर है और माइक्रो-ऑस्मोमीटर का उपयोग करके जांच की जा सकती है।
    3. अमोनियम एसीटेट बफर के साथ 12 अच्छी तरह से प्लास्टिक प्लेट से कुओं की आवश्यक संख्या भरें।
    4. ब्लॉटिंग के लिए फिल्टर पेपर का एक चौथाई काटें, या तो प्रीकट होल के साथ नंबर 1 फिल्टर पेपर से, या मैन्युअल रूप से मुक्का मारने वाले फिल्टर पेपर से 15 मिमी केंद्रीय छेद के साथ 55 मिमी व्यास के फ़िल्टर पेपर से।
    5. झिल्ली को रिंसिंग और डुबकी-फ्रीज करने से पहले अंतिम क्षण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में संग्रहित आवश्यक नमूने को बाहर निकालें।
    6. त्वरित रिलीज संदंश (आमतौर पर एक ड्यूमोंट क्लैंपिंग रिंग उच्च सटीक चिकित्सा चिमटी) के काले क्लैंप रिंग का उपयोग करके चिमटी अनलॉक करें और संस्कृति से एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन को अच्छी तरह से पकड़ें।
      नोट: झिल्ली के पास चिमटी की नोक रखते हुए, सिलिकॉन फ्रेम के बीच पकड़ो। चिमटी को लॉक करने के लिए ब्लैक क्लैंप रिंग को पहली धारियों में ले जाएं।
    7. एसआई3एन4 झिल्ली को ~ 5 एस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए अमोनियम एसीटेट बफर समाधान में खड़ी समर्थन को विसर्जित करें।
      नोट: समर्थन बफर में ऊर्ध्वाधर रहना चाहिए। ध्यान दें कि प्लेट के प्रत्येक कुएं में बफर समाधान का उपयोग एक ही ऊष्मायन स्थितियों के लिए तीन झिल्ली तक किया जा सकता है।
    8. कोशिकाओं को कवर करने वाले अमोनियम एसीटेट जलीय समाधान की पतली और सजातीय परत छोड़ने के लिए झिल्ली रिंसिंग समाधान(चित्रा 4)से अतिरिक्त बफर को बाहर निकालने के लिए फिल्टर पेपर के साथ मैन्युअल रूप से दागें।
      नोट: ऐसा करने के लिए, पहले फिल्टर पेपर पर खिड़की की पीठ दबाएं ताकि लगभग सभी जलीय बफर को अच्छी तरह से और झिल्ली के पीछे शेष हटा या जाए। दूसरा, सामने की ओर दाग, चिमटी के दोनों ओर से शुरू, तो फ्रेम के प्रत्येक पक्ष(चित्रा 4)। झिल्ली को कभी न छुएं। बफर सूखा की अधिकता फिल्टर पेपर पर गठित ऑरेओल के साथ निगरानी की जा सकती है।
    9. पर्यावरण कक्ष का दरवाजा खोलें और जल्दी से चिमटी माउंट करें, इसे संदंश इंटरलॉक में फिसलने दें, और दरवाजा बंद करें(चित्रा 5)।
    10. प्रेस"दाग/एक डुबकी"। एसआई3एन4 झिल्ली पकड़े चिमटी जल्दी से क्रायोजेन में गिर जाएगा ।
    11. प्रीकूल्ड संदंश के साथ स्थानांतरण कंटेनर के ढक्कन को हटा दें।
    12. प्रेस"स्थानांतरण"। एसआई3एन4 झिल्ली को क्रायोजेन से थोड़ा ऊपर ले जाया जाएगा।
    13. एक त्वरित आंदोलन में, चिमटी को संदंश इंटरलॉक से बाहर फिसलने से डिस्कनेक्ट करें और सीधे एलएन2से भरे स्थानांतरण कंटेनर में क्रायो-बॉक्स के खाली स्लॉट में लाने के लिए इंटरलॉक से थोड़ा झुकाव करें। झिल्ली(चित्रा 5)को मुक्त करने के लिए काले क्लैंप रिंग को छोड़ें।
      नोट: स्थानांतरण कंटेनर हमेशा एलएन2के साथ कवर किया जाना चाहिए । जब रिफिल की आवश्यकता हो, तो एलएन2 और एथेन को मिलाने से बचने के लिए मशीन के साथ प्रदान किए गए प्लास्टिक के ढक्कन के साथ एथेन कप को कवर करें।
    14. स्थानांतरण कंटेनर को ढक्कन से ढक दें और एलएन2 से भरे एक छोटे से सफेद पॉलीस्टीरिन कप का उपयोग करें ताकि इसे एलएन2से भरे पॉलीस्टीरिन बॉक्स में स्थानांतरित किया जा पडें।
      नोट: झिल्ली युक्त क्रायो-बॉक्स या ट्यूब को एलएन2 से भरे 50 मिलीएल शंकुई ट्यूबों में संग्रहित किया जा सकता है और एक दीर्घकालिक भंडारण एलएन2 देवर में स्थानांतरित किया जा सकता है। अगले नमूने को फ्रीज करने के लिए शुरू करने से पहले, बर्फ क्रिस्टल के साथ संदूषण से बचने के लिए हेयर ड्रायर या गर्म प्लेट/क्रायोटूल ड्रायर (45 डिग्री सेल्सियस) के साथ सभी ठंडे और पाले से ओढ़े हुए चिमटी को गर्म करें।

5. सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली पर सुसंस्कृत डुबकी-जमे हुए कोशिकाओं को फ्रीज-सुखाने

नोट: फ्रीज सुखाने के लिए, निम्नलिखित कदम एमडीए-एमबी-231 और एचएन दोनों कोशिकाओं पर लागू होते हैं। फ्रीज ड्रायर को ठंडा करने के लिए, आपको 40 00 से 1 घंटे तक इंतजार करना होगा।

  1. फ्रीज ड्रायर की स्थापना
    1. उपकरण के पीछे के पैनल पर स्थित रॉकर स्विच के साथ बिजली स्विच करें।
    2. एलसीडी मेनू के बाद मापदंडों में प्रवेश करना शुरू करें: सेगमेंट 1 = 2 घंटे पर -120 डिग्री सेल्सियस; खंड 2 = 2 घंटे रैंप से -120 डिग्री सेल्सियस से -80 डिग्री सेल्सियस; खंड 3 = 2 घंटे पर -80 डिग्री सेल्सियस; खंड 4 = 2 घंटे रैंप से -80 डिग्री सेल्सियस से 50 डिग्री सेल्सियस; खंड 5 = 2 घंटे पर -50 डिग्री सेल्सियस; खंड 6 = 6 घंटे रैंप से -50 डिग्री सेल्सियस से 30 डिग्री सेल्सियस तक।
    3. पैरामीटर सेट-अप के अंत में, सेटिंग्स को बचाएं, चैंबर ढक्कन बंद करें और"स्टारटी"दबाएं।
    4. यह यूनिट 1.10-5 मीटर तक पंप करेगी। जब यह दबाव पहुंच जाएगा, प्रदर्शन की कमांड लाइन दिखाएगा"अब कूलिंग शुरू करो, जारी रखना शुरूकरो"।
    5. तापमान ट्रिपल प्वाइंट सेटिंग से नीचे के चरण को ठंडा करने के लिए तरल नाइट्रोजन देवर को नियमित रूप से भरें।
      नोट: चरण ट्रिपल प्वाइंट तापमान -140 डिग्री सेल्सियस तक निर्धारित है। इस प्रोटोकॉल के लिए नमूना लोड करने से पहले, 1 घंटे और -160 डिग्री सेल्सियस के तापमान चरण के बारे में इंतजार करना सबसे अच्छा है।
    6. डिस्प्ले में'लोड सैंपल'के लिए तैयार होने पर'प्रेस ईएनटीईआर'दिखाई देगा।
    7. एक एलएन2 भरे पॉलीस्टीरिन देवर के भीतर तरल नाइट्रोजन तापमान के लिए ठंडा करें, आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए नमूना हस्तांतरण धारक, और दो अतिरिक्त पीतल बेलनाकार एसआई3एन4 झिल्ली धारक।
    8. पॉलीस्टीरिन देवर(चित्रा 6ए)में आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए नमूना हस्तांतरण धारक के शीर्ष पर एसआई3एन4 झिल्ली पीतल धारक माउंट करें। एलएन2 के स्तर को पहले पीतल के टुकड़े के शीर्ष किनारे से लगभग 1−2 मिमी तक रखें।
    9. आईनॉक्स या टेफ्लॉन-लेप्ड में प्रीकू-बॉक्स या पीसीआर ट्यूब से एसआई3एन4 झिल्ली नमूना समर्थन उठाएं।
    10. पीतल धारक गिने गुहा में सामना कर रही कोशिकाओं नमूना पक्ष के साथ झिल्ली जमा करें।
    11. एक ढक्कन(चित्रा 6सी)के रूप में दूसरे पीतल के टुकड़े के साथ विधानसभा कवर ।
      नोट: हमने दो पीतल डिस्क डिजाइन किए हैं जिनमें 5 मिमी की मोटाई, 50 मिमी का व्यास और एक केंद्रीय 11 मिमी व्यास छेद है। पहले पीतल डिस्क में समर्थन (5 मिमी x 5 मिमी) को समायोजित करने के लिए 14 मशीनी आयताकार (8 मिमी x 6 मिमी) स्थान हैं। प्रत्येक स्लॉट में 2 मिमी की गहराई के साथ एक फ्लैट और पॉलिश अच्छी तरह से पॉलिश किया गया है। दूसरा पीतल डिस्क एसआई3एन4 झिल्ली पीतल समर्थन को कवर करने के लिए फ्लैट है और एक ठंडा जाल बाड़े के रूप में कार्य करता है।
    12. एलएन2 भर पॉलीस्टीरिन फोम बॉक्स में स्थानांतरण रॉड को प्रीकूल करें और इसका उपयोग पूर्ण असेंबली(चित्रा 6डी, ई)में लॉक करने के लिए करें।
    13. फ्रीज ड्रायर के सामने पैनल पर प्रेस"ENTEआर"।
    14. टर्बो और रोटरी पंप बंद हो जाएगा और चैंबर सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ पर्ज करने के लिए चैंबर के ढक्कन खोलने की अनुमति है ।
    15. तुरंत फ्रीज ड्रायर चैंबर में वसंत भरी हुई हस्तांतरण रॉड के साथ नमूना हस्तांतरण विधानसभा हस्तांतरण और यह तांबे एलएन2 ठंडे चरण पर क्लिप ।
      नोट: कक्ष में स्थानांतरण रॉड के साथ पूर्ण विधानसभा छोड़ दें।
    16. फ्रीज सुखाने चक्र के साथ जारी रखने के लिए फ्रीज ड्रायर चैंबर के ढक्कन को तुरंत बंद करें और"स्टारटी"दबाएं।
    17. फ्रीज ड्रायर के एलएन2 जलाशय को मैन्युअल रूप से हर 2 घंटे भरें।
      नोट: एक स्वचालित एलएन2 फिलिंग सिस्टम इस जलाशय से जोड़ा जा सकता है।
    18. फ्रीज सुखाने चक्र के अंत में, चैंबर वेंट करने के लिए"STOP"प्रेस, और फ्रीज सूखे नमूनों का उपयोग करने के लिए पूर्ण विधानसभा को हटा दें ।

Representative Results

जमे हुए हाइड्रेटेड एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं का एक विशिष्ट ऑप्टिकल वीडियो माइक्रोस्कोप दृश्य जो पॉली-एल-लिसिन लेपित एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन पर उप-संस्कारित थे, चित्रा 7एमें दिखाया गया है। वैक्यूम चैंबर में नमूने का ऑप्टिकल दृश्य ईआरएफ22के ID16A बीमलाइन के समर्पित ऑनलाइन वीडियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रतिबिंब मोड में प्राप्त किया गया था। जबकि इलेक्ट्रॉन या सॉफ्ट एक्स-रे माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिका को एम्बेड करने वाली बर्फ की परत की आवश्यकता होती है जितना संभव हो (आमतौर पर & 0.5 माइक्रोन), हार्ड एक्स-रे (>10 keV) को बहुत अधिक प्रवेश गहराई और कम खुराक जमाव का लाभ होता है। इसलिए बर्फ की मोटाई बड़ी हो सकती है, आमतौर पर कोशिका सहित 10 माइक्रोन ताकि कोशिका को एम्बेड करने वाली बर्फ मोटाई में कुछ μm हो । यह नमूने के बिना तीव्रता की तुलना में संचरण में मापा एक्स-रे तीव्रता के माध्यम से अनुमान लगाया जा सकता है, खाते में ५०० एनएम मोटी एसआई3एन4 झिल्ली के अवशोषण को ध्यान में रखते हुए । इस बर्फ की मोटाई मैनुअल ब्लॉटिंग के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है जैसा कि वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित है। न्यूटन के छल्ले क्षेत्र में, बर्फ की मोटाई भी पतली हो सकती है (मापा नहीं गया)।

फ्रोजन हाइड्रेटेड सेल के एक्स-रे फ्लोरेसेंस एलिमेंटल मैपिंग को चित्रा 7बी में पोटैशियम (के), सल्फर (एस), और जिंक (Zn) जैसे शारीरिक तत्वों के प्रतिनिधि वितरण के साथ दिखाया गया है। ये नक्शे मौलिक वास्तविक द्रव्यमान (यानी, मौलिक अनुमानित द्रव्यमान) का प्रतिनिधित्व करते हैं। जबकि वर्तमान मामले में नहीं किया गया, ऐसे नक्शे एक्स-रे प्रचार आधारित चरण कंट्रास्ट इमेजिंग के माध्यम से सामान्यीकृत किया जा सकता है जो अनुमानित नमूना द्रव्यमान23का अनुमान ित करता है। जैसा कि कई अध्ययनों से बताया गया है, उनके निकट-देशी राज्य में संरक्षित कोशिकाओं में अत्यधिक विसारक कश्मीर आयन कोपूरे सेल23,24,16में सजातीय रूप से वितरित माना गया था। जैसा कि चित्र 7बीमें 2डी एक्स-रे फ्लोरेसेंस मौलिक छवियों में दिखाया गया है, कसकर बाध्य तत्व एस को समान रूप से सेल के भीतर वितरित किया गया था, इसी तरह कश्मीर के लिए, और सेलुलर मास प्रोफाइल का एक अच्छा अनुमान का प्रतिनिधित्व करता है। जेडएन वितरण में साइटोसोल की तुलना में नाभिक में अधिक संकेत था और स्पष्ट रूप से नाभिक को रेखांकित किया गया था। यह ध्यान दिया जा सकता है कि परमाणु क्षेत्र में स्थानिक संकल्प (५० एनएम) में छोटे जेडएन-समृद्ध क्षेत्रों का पता लगाया जा सकता है ।

मौजूदा एक्स-रे नैनोप्रोब्स या बनाए जाने वाले लोग जरूरी नहीं कि क्रायोजेनिक क्षमताओं को समायोजित करें। इस मामले में, उप-100 एनएम स्थानिक संकल्पों पर कोशिकाओं की एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प सेल की डुबकी-फ्रीजिंग के बाद इस प्रोटोकॉल में वर्णित फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया करना है। चित्रा 8ए परिणामी फ्रीज-सूखे प्राथमिक माउस हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स सीधे एसआई3एन4 झिल्ली पर सुसंस्कृत के एक ठेठ उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी दृश्य से पता चलता है । इस मामले में, यदि एक साफ-सुथरे कक्ष में संग्रहीत किया जाता है, तो नमूनों को 1−2 सप्ताह पहले तैयार किया जा सकता है और ब्याज के क्षेत्रों के पंजीकरण के लिए एक साधारण ईमानदार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ मनाया जा सकता है। देखभाल परिवेश आर्द्रता के संपर्क को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए क्योंकि यह फ्रीज-सूखे नमूने द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है और एक्स-रे नैनोबीम के तहत नुकसान का कारण बन सकता है। इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक बहुत संवेदनशील कोशिकाओं (यानी, न्यूरोनल कोशिकाओं) के लिए लागू किया गया था और यहां तक कि बेहतर परिणाम कैंसर कोशिकाओं जैसे अन्य अधिक मजबूत प्रकार की कोशिकाओं के साथ प्राप्त किए गए थे। डुबकी-फ्रोजन कोशिकाओं के लिए, पूरे फ्रीज-सूखे सेल डिस्प्ले पर कश्मीर, एस और जेडएन की एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवियां ऊपर वर्णित लोगों के समान हैं। वे 50−100 एनएम स्थानिक संकल्प पर विभिन्न प्रकार के फ्रीज-सूखे कोशिकाओं में पाए जाने वाले मौलिक वितरणों के प्रतिनिधि हैं। जबकि फ्रीज सुखाने वाली पूरी कोशिकाएं मौलिक अखंडता को संरक्षित करने के लिए एक विकल्प है, यह सेल आकृति विज्ञान16,विशेष रूप से कोशिका झिल्ली के एक आदर्श संरक्षण की कीमत पर है।

Figure 1
चित्रा 1: एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण के लिए विशिष्ट नमूना समर्थन। इसके सुरक्षात्मक कैप्सूल में एक एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन करती है। इस प्रकार के सब्सट्रेट का उपयोग कमरे के तापमान विश्लेषण (कम तापमान और कम वैक्यूम फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया के बाद डुबकी-फ्रीज सेलुलर तैयारी) या क्रायोजेनिक एक्स-रे फ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए दोनों के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल सीडिंग के बाद सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों का योजनाबद्ध दृश्य। कोशिकाओं को सीधे एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन की पॉली-एल-लिसिन लेपित फ्लैट सतह पर सुसंस्कृत किया जाता है। कभी-कभी हवा के बुलबुले एसआई3एन4 झिल्ली समर्थन की बैकसाइड गुहा में फंस सकते हैं और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में हटाना होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इन-हाउस ने तरल नाइट्रोजन देवर में डुबकी जमे हुए एसआई3एन4 झिल्ली के दीर्घकालिक भंडारण के लिए 3 डी मुद्रित क्रायो-बॉक्स विकसित किया। (ए)क्रायो-बॉक्स कंटेनर और कैप्स (निचले हिस्से) और(बी)लॉक ्ड कैप ्स के साथ इकट्ठे क्रायो-बॉक्स के साथ अलग हो गया । टोपियां चिमटी के साथ हेरफेर किया जा सकता है, खोलने या रोटेशन द्वारा ताला लगा । ईएसआरएफ ID16A के अनुरोध पर 3डी प्रिंटिंग के लिए एक विस्तृत योजना उपलब्ध है। सिलिकॉन नाइट्राइड टेम ग्रिड को समायोजित करने के लिए डिजाइन बनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एसआई3एन 4 पर सुसंस्कृत कोशिकाओं का ब्लॉटिंग। एक एसआई3एन4 झिल्ली पर सुसंस्कृत सेल मोनोलेयर को डुबकी लगाने से पहले अमोनियम एसीटेट समाधान(ए)में धोया जाना चाहिए और फिल्टर पेपर(बी)का उपयोग करके मैन्युअल रूप से मैन्युअल रूप से दागदिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: स्वचालित डुबकी-ठंड EM-जीपी मशीन । (A)स्वचालित डुबकी फ्रीजर। (ख)चिमटी के साथ पर्यावरण कक्ष में बंद कर दिया ।(सी)एथेन कप एक एथेन बोतल से जुड़े Leica तरलफायर के साथ कवर किया । (डी)डुबकी-ठंड बाड़े काले कप तरलीकृत इथेन से भरा और विट्रीफाइड एसआई3एन4 झिल्ली के एलएन2 में आगे भंडारण के लिए क्रायो बॉक्स दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: फ्रीज सुखाने की प्रक्रिया के लिए नमूना क्रायोट्रांसफर विधानसभा। (A)एसआई3एन4 झिल्ली के लिए पहला पीतल प्राप्तकर्ता फ्रीज ड्रायर आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए नमूना हस्तांतरण धारक के शीर्ष पर रखा गया है। (ख)और(सी)बताते हैं कि दूसरे फ्लैट पीतल डिस्क को कवर के रूप में इस्तेमाल किया जाता है और फ्रीज ड्रायर के वैक्यूम बाड़े में डालने के लिए कोल्ड ट्रैप बाड़े का काम करता है । (D)वसंत से भरी हुई स्थानांतरण छड़ी के साथ पूर्ण विधानसभा। (ई)एसआई3एन4 झिल्ली पर उगाई जाने वाली विट्रीफाइड सेलुलर तैयारी को ले जाने वाले नमूना धारक को एलएन2-कूल्डफ्रीज ड्रायर में आगे डाला जाना चाहिए । विधानसभा बढ़ते के लिए सभी कदम एक स्टायरोफोम बॉक्स में एलएन2 में किया जाता है। स्पष्टता के लिए, सभी छवियों को एलएन2की अनुपस्थिति में उत्पादित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: हार्ड एक्स-रे नैनोप्रोब का उपयोग करके जमे हुए हाइड्रेटेड सेल की क्रायो-एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवियां। (A)एस्आरएफ ID16A बीमलाइन के समर्पित ऑप्टिकल वीडियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करप्रतिबिंब मोड में विशिष्ट ऑनलाइन दृश्य। मैनुअल ब्लॉटिंग के बाद, लगभग 5−10 माइक्रोन की कुल बर्फ की मोटाई हासिल की गई थी जो जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देती है। न्यूटन के छल्ले के साथ एक क्षेत्र भी बहुत पतली बर्फ का संकेत ध्यान देने योग्य है । (ख)प्रतिनिधि क्रायो-एक्स-रे फ्लोरेसेंस सेलुलर वितरण शारीरिक तत्वों पोटेशियम (कश्मीर), सल्फर (एस), और जिंक (Zn) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: हार्ड एक्स-रे नैनोप्रोब का उपयोग करके फ्रीज-सूखे न्यूरोनल सेल की एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवियां। (A)परिणामी फ्रीज-सूखे प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरोनल कोशिकाओं के विशिष्ट उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी दृश्य सीधे एसआई3एन4 झिल्ली पर सुसंस्कृत । स्केल बार = 200 माइक्रोन(बी)प्रतिनिधि कक्ष तापमान एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवियां एक फ्रीज-सूखे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन की शारीरिक तत्वों पोटेशियम (कश्मीर), सल्फर (एस), और जिंक (Zn) के वितरण को दिखाती है। स्केल बार = 2 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) ने रसायन विज्ञान में २०१७ नोबेल पुरस्कार जीता और इस तरह के समाधान25में जैव अणुओं के उच्च संकल्प संरचना निर्धारण के लिए जैविक सामग्री के विट्रीफिकेशन पर जे डबोशे द्वारा किए गए विकास के रूप में । के रूप में अपने नोबेल व्याख्यान में Dubochet द्वारा रिपोर्ट "कैसे पानी की एक बूंद को विवर्तित करने के लिए एक बात है, जैविक अवलोकन के लिए एक जैविक नमूना तैयार एक और है"25। क्रायोतैयारी कदम अब विकिरण खुराक क्षति और उनके मूल राज्य के करीब कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए मानक तकनीक माना जाता है । तैयारी थकाऊ बनी हुई है, लेकिन । इसका कारण यह है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इसके नायाब स्थानिक संकल्प के कारण, नमूना तैयारी के दौरान होने वाले किसी भी अल्ट्रास्ट्रक्चरल विरूपण साक्ष्य के प्रति संवेदनशील है। सिंक्रोट्रॉन क्रायोनिनोप्रोब्स अब उच्च ऊर्जा एक्स-रे रेंज26में 13 एनएम के रूप में कम स्थानिक संकल्पों के लिए नीचे जा रही इसी तरह की कठिनाइयों के करीब पहुंच रहे हैं । हार्ड एक्स-रे माइक्रोस्कोपी पूरी कोशिकाओं का विश्लेषण कर सकती है जबकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रॉनों की खराब पैठ गहराई से ग्रस्त है जो केवल बहुत पतली कोशिका स्लाइस को देखा जा सकता है।

कोशिकाओं के मोनोलेयर काफी पतले होते हैं ताकि तरल इथेन में डुबकी-फ्रीजिंग से, पानी विट्रीफिकेशन के लिए आवश्यक शीतलन दरें प्राप्त हो जाती हैं। सिद्धांत रूप में, १०८ K/s के रूप में उच्च के रूप में ठंडा दर उच्च दबाव ठंड27 जो डुबकी ठंड के लिए भी मोटी नमूनों के vitrification की अनुमति देता है का उपयोग संभव हैं । परिवेश दबाव28पर नमूने के पूर्ण विट्रीफिकेशन की अनुमति देने के लिए आवश्यक 105 K/s की एक शीतलन दर, स्वचालित डुबकी-फ्रीजिंग मशीन और यहां प्रस्तुत मापदंडों का उपयोग करके पुन: उत्पादन तक पहुंच जाती है। यह एक शोधकर्ता को तरल इथेन में डुबकी-फ्रीजिंग द्वारा12,13,14,15,29,30 कोशिकाओं के मोनोलेयर जैसे पतले जैविक नमूनों (<10 μm) को विवर्तित करने की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल के साथ एक महत्वपूर्ण चुनौती 2डी या 3 डी में सेल के भीतर विश्वसनीय मौलिक वितरण प्रदान करने के लिए इंट्रासेलुलर सामग्री की रासायनिक अखंडता को यथासंभव संरक्षित करना है। जैसा कि उपकोशिकीय स्तर पर मौलिक इमेजिंग के मामले में2,16,17,31कहीं और प्रकाशित किया गया है, जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं के विश्लेषण पर विचार किया जाना चाहिए। अन्यथा, कोशिकाओं के डुबकी-फ्रीजिंग और फ्रीज-सुखाने के संयोजन का उपयोग कमरे के तापमान विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध के लिए, अरूप बर्फ को उदात्तीकरण की प्रक्रिया के माध्यम से हटा दिया जाता है, जबकि बंधे पानी के अणुओं को अवशोषण की प्रक्रिया के माध्यम से हटा दिया जाता है। सेलुलर झिल्ली के संभावित परिवर्तन और कुछ उपकोशिकीय संरचनाओं की आकृति विज्ञान32के कारण यह प्रक्रिया जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों की तुलना में आदर्श से दूर हो सकती है। इसके अलावा, विशिष्टता अध्ययन के लिए, पानी निकालने धातु नमूना कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । फिर भी, यह सफल रहा है और उप-100 एनएम स्तर2,16,17,18,20,33,34,35,36पर मौलिक इमेजिंग के लिए जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों का सबसे अच्छा विकल्प है।

जैसा कि37की रिपोर्ट की गई है, क्रायोप्रिजर्वसेलुलर तैयारी की गुणवत्ता का मूल्यांकन पोटेशियम-टू-सोडियम के/एनए अनुपात के माध्यम से किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, यह अभी तक कठिन एक्स-रे नैनोप्रोब के साथ निर्धारित नहीं किया जा सकता है, सिलिकॉन बहाव डिटेक्टर के कम ऊर्जा कट-ऑफ के कारण तत्वों के एक्स-रे फ्लोरेसेंस फोटॉन (ई ♫ 1.3 केवी मैग्नीशियम) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। दरअसल, एक उच्च K/Na अनुपात (>10) जिसे टीओएफ-सिम्स, ईपीएमए या न्यूक्लियर माइक्रोप्रोब PIXE16,37 का उपयोग करके मापा जा सकता है, एक जीवित सेल37में 25 की अपेक्षित K/Na की तुलना में सेल की संरक्षित रासायनिक अखंडता का संकेत है। इसे सहवर्ती कम सीएल /के अनुपात38द्वारा समर्थित किया जा सकता है । फिर भी, अपूर्ण विट्रीफिकेशन, खासकर यदि नमूना ठंडा करने की गति बहुत कम है, तो बड़े बर्फ क्रिस्टल के गठन का कारण बन सकता है जो कोशिका झिल्ली और ऑर्गेनेल्स को नुकसान पहुंचा सकता है, नतीजतन रासायनिक तत्वों के वितरण में फेरबदल कर सकता है। यद्यपि इंट्रासेलर वितरण पर इस संभावित क्षति और प्रभाव की निगरानी करने के लिए कोई नियमित प्रक्रिया नहीं है, उपरोक्त मौलिक अनुपात और एक्स-रे चरण कंट्रास्ट या क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च संकल्प पर सेल को छवि देने की संभावना मौलिक अखंडता के सहवर्ती संरक्षण के साथ इंट्रासेल्युलर डिब्बों के अच्छे संरक्षण का समर्थन करने के लिए सबसे अच्छा दृष्टिकोण हो सकता है। इन तकनीकों के संयोजन और नव विकसित क्रायोकोरसापेक्ष फ्लोरेसेंस ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग यह आकलन करने में मदद करेगा कि यह नुकसान किस हद तक होता है और इंट्रासेलुलर मौलिक वितरण को प्रभावित करता है।

कुल मिलाकर, सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण के लिए सेलुलर नमूने तैयार करने के लिए एक विस्तृत और व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह अनुसंधान समुदाय के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, जो 2डी और 3डी मौलिक इमेजिंग (क्रायो) हार्ड एक्स-रे नैनोप्रोब्स के लिए उपयुक्त सेलुलर नमूने तैयार करने के कठिन मुद्दे को हल करने में मदद करता है। इन दृष्टिकोणों को कोशिकाओं के गहन सहसापेक्ष रासायनिक और संरचनात्मक इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्षमताओं के साथ मिलाया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

नैनो-इमेजिंग बीमलाइन ID16A पर प्रयोगESRF प्रस्तावLS2430, LS2303, और LS2765 के फ्रेम में किए गए थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O SIGMA 09691-250mL One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x Life Technologies, Invitrogen 17504-044 for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) GIBCO 14190-094 cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) GIBCO 21885025 cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies, Invitrogen 31966-02 for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology World Precision Instrument 501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer Quorum Technology EK3147
Ethane N45 Air Liquid p0505s05r0a001 C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin GIBCO A31604-02 cell culture
HBSS 10x Life Technologies, Invitrogen 14185-052 for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps Leica 16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell ATCC ATCC HTB-26 cell culture
Neurobasal medium Life Technologies, Invitrogen 21103-049 for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate Thermo Fisher 176740 cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer Advanced Instruments Osmo1 Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin SIGMA P4333 cell culture
poly-L-lysine SIGMA P4707 Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit Leica 16706401 Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4) Silson Ltd. SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4% GIBCO 15250061 cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05% GIBCO 25300-054 cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water Fisher Chemicals W9-1 MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole Leica 16706440 Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.

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References

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