Summary
Терапия сопротивление часто развивается у пациентов с прогрессирующим раком простаты, а в некоторых случаях, рак прогрессирует до смертельного подтипа называется нейроэндокринный рак предстательной железы. Оценка небольших некодирующих РНК-опосредованных молекулярных изменений, которые облегчают этот переход позволит лучше стратификации болезни и выявления причинных механизмов, которые приводят к развитию нейроэндокринного рака предстательной железы.
Abstract
Абляция рецепторов андрогенов (AR) сигнализации андрогенов лишения является целью первой линии терапии рака простаты, что первоначально приводит к регрессии рака. Однако, в значительном числе случаев, болезнь прогрессирует до передовых, кастрации устойчивый рак предстательной железы (CRPC), который имеет ограниченные терапевтические возможности и часто агрессивно. Дистанционные метастазы в основном наблюдаются на этой стадии агрессивного заболевания. CRPC лечится вторым поколением ингибиторов AR пути, которые улучшают выживание на начальном этапе, а затем появление резистентности терапии. Нейроэндокринный рак предстательной железы (NEPC) является редким вариантом рака предстательной железы (PCa), который часто развивается в результате терапии устойчивость через процесс трансдифференцации, известный как нейроэндокринная дифференциация (NED), в котором PCa клетки проходят линию переключатель от аденокарциномы и показать повышенное выражение нейроэндокринной (NE) линии маркеров. В дополнение к геномным изменениям, которые управляют прогрессией и трансдифференциацией к NEPC, эпигенетические факторы и микроэкологические сигналы считаются важными игроками в продвижении болезни. Данная рукопись содержит подробный протокол для выявления эпигенетических драйверов (т.е. небольших некодирующих РНК), которые связаны с передовыми PCa. Использование очищенных микроРНК из формалина-фиксированного парафина-встроенных (FFPE) метастатических тканей и соответствующих сывороточных внеклеточных пузырьков (EVs), протокол описывает, как подготовить библиотеки с соответствующим контролем качества для секвенирования микроРНК из этих источников выборки. Изолировать РНК как от FFPE, так и от EVs часто является сложной задачей, поскольку большая ее часть либо деградирует, либо ограничена в количестве. В этом протоколе будут разработаны различные методы оптимизации входов РНК и библиотек кДНК для получения наиболее конкретных считываний и высококачественных данных при секвенировании.
Introduction
Рак предстательной железы обусловлен андрогенов, действующих через AR сигнализации. Таким образом, ориентация на путь AR является основой лечения болезни1. Тем не менее, сопротивление часто наступает в результате целенаправленной терапии и болезнь прогрессирует до передовых метастатических CRPC2. CRPC лечится вторым поколением AR терапии, которая включает в себя энзалутамид и абиратерон2, 3, который улучшает выживание на начальном этапе. Тем не менее, смертельные варианты, такие как NEPC часто возникают в 25-30% обработанных случаев CRPC, которые имеют ограниченные варианты лечения, что приводит к увеличению смертности3. NEPC возникает через обратимый процесс трансдифферециации, известный как NED, в котором pCa клетки проходят линию переключатель от аденокарциномы и показать снижение экспрессии AR и увеличение экспрессии NE маркеров линии, включая энолазу 2 (ENO2), хромогранин A (CHGA), и синаптофизин (SYP)4. Учитывая, что эти варианты сопротивления возникают в результате терапевтических вмешательств, важно расшифровать пути, которые приводят к генерации этого смертельного, трудно поддающееся лечению формы PCa.
Геномика NEPC была недавно расшифрована в исчерпывающем исследовании, проведенном Beltran et al., в котором былипроанализированыизменения числа копий, мутации, однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) и метилирование ДНК из метастатических тканей, полученных пациентом. Несмотря на значительное продвижение в понимании геномики этой агрессивной формы PCa, мало что известно об эпигенетических факторах, в том числе небольших некодирующих РНК (микроРНК), которые участвуют в переходе CRPC-аденокарциномы на NEPC. МикроРНК (miRNAs) 22 bp длиной, двуцейцы РНК, которые действуют в первую очередь путем подавления экспрессии генов после транскрипционно последовательности по последовательности конкретных взаимодействий с 3'-непереведенных регионов (UTRs) коньяк мРНК цели6. Несколько онкомиров и супрессоры опухоли в настоящее время определены, и их роль в регулировании начала заболевания и метастазирования был хорошо изучен в различных раковыхзаболеваний 6,7. Эти небольшие некодивные РНК часто служат очень важными целями в борьбе со смертностью от болезней6,8,9. Более поздние исследования были сосредоточены на понимании паракринных эффектов miRNAs в метастазы рака через их транспорт в EVs, таких как экзосомы, которые текут в крови и позволяют опухолевые клетки, чтобы отправить эти вторичные посланники метастатических местах в нуклеазной свободной среде10,11,12. EVs нести miRNAs из опухолевых клеток для передачи трансформирующих эффектов от клеток-хозяев12. Идентификация EVs как вторичные посыльных опухолевых клеток может быть полезна в неинвазивном выявлении тяжести заболевания.
miR-1246 высоко upregulated в EVs от агрессивного PCa, и это указывает на тяжесть заболевания13. Эти связанные с EV миРНК не только служат неинвазивными биомаркерами заболевания, но и играют функционально важную роль в продвижении опухолевого интогенеза. Таким образом, важно понять значение репертуара miRNA, который связан с устойчивыми формами PCa, чтобы лучше идентифицировать неинвазивные биомаркеры, а также их функциональное значение.
Появление следующего поколения секвенирования предложил наиболее полную платформу для изучения деталей опухолевого ландшафта с участием изменений в геноме, таких как мутации, хромосомные переселения, хромотрипс, и метилирование, все из которых вносят значительный вклад в форму и природу рака14,15,16. Кроме того, это также важный инструмент, чтобы понять огромные эпигеномные изменения, которые происходят в опухолевой клетке и которые часто являются важными игроками в тяжести заболевания17. С целью понимания репертуара miRNA, связанного с генерацией NEPC, небольшое секвенирование РНК было выполнено на метастатических тканях FFPE CRPC и их соответствующих EVs, полученных в сыворотке. РНК, полученная из любого из этих двух источников выборки (1) с низким уровнем урожайности и (2) плохого качества из-за деградации, которая часто происходит из-за фиксации формалина и изоляции EV. Кроме того, создание библиотек кДНК является критическим, но громоздким шагом последовательности. Таким образом, методы изоляции этих РНК и их использования для генерации библиотек для мелкого секвенирования РНК требуют оптимизации для генерации точных и надежных данных.
Существует несколько методов профилирования экспрессии miRNA в различных образцах, включая RT-PCR, microarrays и гибридизацию на месте (ISH). Протокол с использованием FFPE ткани полученных РНК для оценки экспрессии miRNA по RT-PCR и ISH был недавно опубликован18. Более поздние технологии предлагают более исчерпывающие и всеобъемлющие платформы для профилирования выражения miRNA в выборке. NanoString nCounter предлагает чувствительную платформу обнаружения miRNA19, но обнаружение часто ограничивается количеством miRNAs, которые доступны в массиве (2000 евро). В таком сценарии более чувствительная и исчерпывающая платформа, такая как секвенирование следующего поколения, предлагает гораздо более широкую глубину идентификации miRNA и одновременного профилирования в различных образцах20. Метод был использован для определения сигнатур miRNA в моче или плазме от пациентов PCa21,22,23. В текущей статье представлен протокол для использования платформы секвенирования следующего поколения для изучения профилей miRNA, связанных с агрессивными CRPC с использованием тканей FFPE и сывороточных EV РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с этическими принципами Общего правила США и было одобрено Институциональным комитетом по исследованиям в области человека.
1. Микродиссекция
ПРИМЕЧАНИЕ: FfPE метастатической CRPC тканей с особенностями аденокарциномы (CRPC-Adeno) или NE дифференциации (CRPC-NE) были получены из рака предстательной железы биопозиторий сети (PCBN). Десять микрон PCa разделы на стеклянных слайдах были подготовлены для ручного микродиссекции, как обсуждалось ранее18. Кратко обобщив:
- Депарафинизировать участки тканей, замачивая слайды в ксилене (2x, 10 мин каждый). Затем увлажнить секции путем инкубации слайдов в течение 5 минут каждый в градуированных этанола (100%, 95%, 90%, 80%, и 70%), а затем дистиллированной воды мыть и окрашивание с гематаклином (30 с замочить).
- После окрашивания гематоксилина промойте секции тканей водой. Затем обезвоживают участки тканей, поместив их в градуированный этанол (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 мин каждый), а затем ксилен (5 мин).
- Проанализируйте соответствующие гематоксилин и эозин (Н И Е) слайды для выявления опухолевых участков (наверху, аденокарциномы или NED) и пометить эти опухолевые участки и нормальные прилегающие области с помощью сертифицированного патологоанатома. Используя эти H и E слайды в качестве дорожных карт, отметьте гематоксилин окрашенных тканей, полученных в вышеупомянутом шаге, чтобы различать опухоль и нормальные области.
- Тщательно вскрыть отмеченную ткань под микроскопом с помощью скальпеля.
- Соберите расчлененные ткани из нормальных и раковых областей в отдельных трубках с помощью электростатически заряженных гель загрузки пипетки советы. Заряженный наконечник привлекает расчлененные ткани и позволяет максимально восстановить ткани после вскрытия. Как только ткань прилипнет к заряженной наконечнику, разрежьте кончик на пустую трубку для сбора 2 мл.
2. Изолирование EVs, полученных в сыворотке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные образцы сыворотки пациента, собранные у пациентов с метастатическимИ CRPC с характеристиками аденокарциномы (CRPC-adeno) или NE дифференциации (CRPC-NE), были закуплены у PCBN с использованием утвержденного протокола IRB и хранились при -80 градусов по Цельсию до их использования. Образцы сыворотки были собраны из того же набора пациентов, что и те, которые используются для микрорасчлененных тканей, чтобы позволить сравнение между соответствующими тканями и ЭВ сыворотки. Для сбора EVs использовался коммерчески доступный сывороточный изоляционный реагент.
- Оттепель замороженных образцов сыворотки пациента при 4 градусах Цельсия.
- Используйте 110 л оттаяваемых образцов сыворотки и вращайте при 2000 х г в течение 30 мин.
- Соберите супернатант для последующей изоляции EV/экзосомы и отбросьте гранулы мусора. Добавьте 30 qL серово-экзосомного реагента изоляции в супернатант и инкубировать при 4 градусах По цельсию в течение 30 минут.
- Спин при 10000 х г в течение 10 мин. Соберите EV-обедосканной сыворотки тщательно, не нарушая гранулы в отдельной трубке 1,5 мл и хранить при -80 градусов по Цельсию для будущего анализа, если это необходимо.
- Повторное увеличение гранул EV в 70 л фосфатного буферного солья (PBS), приготовленного в воде без нуклеаза. Держите аликот для системы анализа слежения за частицами для оценки качества и количества частиц. Храните остальную часть образца при -80 градусов до дальнейшего анализа.
3. Изоляция РНК от микрорассеченных тканей простаты и ЭВ
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая РНК была выделена из микрорассеченных тканей и очищенных EVs с использованием коммерчески доступного комплекта(Таблица материалов) в инструкции производителя с несколькими модификациями. В следующих разделах кратко описывают эти процедуры с особым акцентом на важные шаги:
- Изолировать РНК из микрорасчлененных тканей.
- Приостановите микрорасчлененные ткани FFPE в 150 л буфера протеиназа K. Смешайте путем вихря и пипетки из остаточной ткани из кончика. Спин при 11 000 х г в течение 1 мин.
- Добавьте в гранулы 10 л протеиназе К. Подождите 2 минуты, пока гранулы не побелеет. Пипетка вверх и вниз несколько раз.
- Инкубировать при 56 градусах по Цельсию в течение 16 мин. Вортекс каждые 3 мин.
- Снимите образцы и дайте тепловому блоку достичь 80 градусов по Цельсию. Инкубировать образцы на блоке в течение 16 мин. Vortex каждые 3 мин.
- Инкубировать на льду 3 мин.
- Спин при 20 000 х г в течение 15 мин. Перенесите супернатант в новую трубку 2 мл.
- Добавьте 16 зЛ буфера бустера DNase, за которым следует 10 кЛ DNase I. Смешайте, аккуратно инвертируя трубку и инкубируя при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
- Добавьте 320 кл блочного буфера из красных кровяных телец (РБК). Смешайте путем инвертирования трубки, а затем добавить 1120 л 100% этанола. Немедленно перенесите на спиновые столбцы, хранящиеся при 4 градусах Цельсия. Спин при 8000 х г на 30 с.
- Вымойте столбцы 2x с буфером мытья и спина столбцов на 20000 х г в течение 5 минут, чтобы удалить остаточный буфер стирки.
- Дайте спиновой колонке высохнуть в течение 2-3 мин, затем выветривайте с 19 qL безrовой воды. Извилите очищенную РНК на спектрофотометре и нормализуйте образец до 40 нг/Л.
- РНК изоляции от сыворотки полученных EVs.
- Изолировать экзосомальную РНК с помощью комплекта. Добавьте 75 зл и 9,3 л буфера лисиса В до 50 зл очищенной суспензии EV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте смешивать образец, инвертируя трубку в течение примерно 10 минут, чтобы обеспечить полный лиза EVs. - Добавьте 130 л 100% этанола и сразу же перемешайте, инвертируя образец. Передача на спин колонке, а затем спина на 3300 х г в течение 1 мин.
- Вымойте столбец 2x буфером для мытья. Спин колонки на 1300 х г в течение 3 минут, чтобы полностью удалить буфер стирки.
- Дайте столбце высохнуть в течение 2 мин. Добавьте 18 qL буфера elution в колонку и дайте ему посидеть 2 мин. Спин при 400 х г в течение 1 мин, а затем второй спин на 5800 х г в течение 3 мин.
- Повторите шаг 3.2.4 с элекрытным буфером, включенным в комплект, чтобы увеличить выход РНК из образца.
- Количественная оценка образца на спектрофотометре и нормализуйте его до 40 нг/Л.
- Изолировать экзосомальную РНК с помощью комплекта. Добавьте 75 зл и 9,3 л буфера лисиса В до 50 зл очищенной суспензии EV.
4. Подготовка библиотеки к секвенированию малых РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой набор подготовки библиотеки РНК(Таблица материалов) был использован для создания библиотек кДНК из изолированных образцов РНК. Шаги по генерации библиотек, очистке и проверке качества перед запуском на секвенсоре имеют решающее значение для любого протокола секвенирования, поскольку они в конечном итоге определяют качество выходных данных из запуска. Поэтому, действуйте осторожно с каждым шагом. Руководящие принципы от производителя предлагают использовать как минимум 50 нг РНК. Учитывая низкое качество и низкое количество общего РНК обычно получают из этих двух источников образца, этот протокол оптимизирован для концентрации РНК как низко как 100 нг. Протокол ниже для одного образца библиотеки.
- Генерировать адаптер-лигатный кДНК.
- Используйте 5 qL нормализованного (40 нг/Л) образца РНК. Добавьте 1 зл из 3' адаптера. Разогреть тепловой циклист до 70 градусов по Цельсию до инкубации образцов. Инкубировать в течение 2 мин. Немедленно перенесите пробы на лед до перехода на следующий шаг.
- В отдельной трубке смешайте 2 qL буфера перевязочения, 1 qL ингибитора RNase и 1 Зл T4 РНК Ligase 2, мутант удаления. Смешайте путем pipetting вверх и вниз и добавить 4 злиц этой смеси в трубку с АДАптером РНК/3.
- Передача на термальный велосипедист, который был разогрет до 28 градусов по Цельсию и инкубировать в течение 1 ч.
- Добавьте 1 зл стоп-раствор, сохраняя при этом образцы на тепловом блоке. Инкубировать при 28 градусах по Цельсию еще 15 мин.
- Снимите трубки и держите на льду сразу после этого шага.
- В отдельной трубке добавьте 1 зл 5-го адаптера.
- Передача на термальный велосипедист, который был разогрет до 70 градусов по Цельсию и инкубировать в течение 2 мин.
- Немедленно поместите трубку на лед, чтобы предотвратить повторное аннулирование адаптеров.
- Добавьте 1 зл 10 мМ АТФа в трубку денатурированного 5' адаптера. Смешайте путем пипетки и добавить 1 зл T4 РНК лигаза в смеси. Смешайте путем пипетки и добавить 3 злиц этой смеси в трубку, содержащую 3' адаптер-ligated РНК. Передача на тепловой цикл, который был разогрет до 28 градусов по Цельсию и инкубировать в течение 1 ч.
- Немедленно перенесите на лед и либо продолжить с образцами или хранить на -20 градусов по Цельсию для будущего использования.
- Для выполнения RT-PCR используйте 6 л каждой адаптер-лигатной РНК и добавьте к ней 1 злиц грунтовки РНК RT. Передача на тепловой цикл, который был разогрет до 70 градусов по Цельсию. Инкубировать в течение 2 мин.
- В отдельной трубке смешайте 2 злитровых буфера 5x нитей, 0,5 л 12,5 мМ dNTPs, 1 кЛ 100 мМ DTT, 1 кЛ ингибитора RNase и 1 л обратной транскриптазы. Добавьте 5,5 кл этой смеси в адаптер-лигатированную РНК и перенесите в тепловой циклатор, который был разогрет до 50 градусов по Цельсию. Инкубировать 1 ч.
- Перенесите адаптер-лигатную кДНК немедленно на лед.
- В отдельной трубке смешайте 25 л пЦР-микса, 2 злиц пропраймера РНК ПЦР, 2 Зли индекса проиндекса РНК ПЦР и 8,5 л воды без RNase. Добавьте 37,5 л этой смеси к 12,5 л адаптер-лигатной кДНК. Передача на тепловой цикл, который был разогрет до 98 градусов по Цельсию. Программа теплового велосипедиста, как это предлагается в протоколе производителя с номером цикла изменен до 15 вместо 11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности всех используемых грунтовок перечислены в таблице материалов. - Держите образцы на 4 градусах Цельсия после завершения. Продолжить с ними или хранить на -80 градусов по Цельсию для будущего использования.
- Очистите и выполните контроль качества для ligated cDNA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Усиленная кДНК была очищена от геля, следуя протоколу производителя, за исключением нескольких модификаций для улучшения качества и урожайности очищенных образцов кДНК, как показано ниже.- Используйте 6% гелей Полиакриламид TBE для очистки усиленной кДНК. Разбавить лестницу высокого разрешения (HRL) и пользовательскую РНК-лестницу (CRL) с равными объемами погрузочного красителя ДНК.
- Добавьте 10 кЛ красителя загрузки ДНК к каждому образцу кДНК. Выполнить 30 зл и каждого образца в двух отдельных полосах, прилегающих друг к другу с CRL и HRL в промежуточном пространстве между двумя различными образцами.
- Запустите гель в буфере 1x TBE при 145 V в течение приблизительно 30–40 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за нижней синей передней части погрузочного красителя. Остановите электрофорез, когда он приближается к нижней части геля. - Передача геля в буфере 1x TBE с Ethidium Bromide (EtBr) на 0,5 мкг EtBr/1 mL 1x TBE.
ПРЕДЕКТО: EtBr является известным канцерогеном, и каждый шаг отсюда, пока иссечение из геля должно быть выполнено с крайней осторожностью. - Визуализируйте гель в трансиллюминаторе и вырежьте гель точно между 145 bp и 160 bp маркером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Димы адаптера работают очень близко к маркеру 145 bp. Таким образом, вырезать гель немного выше 145 bp маркер, чтобы избежать загрязнения с адаптер димер. - Передача геля на ДНК нарушение труб хранится в 2 мл сбора труб. Спин при 20000 х г в течение 2 мин. Добавить 300 л без RNase воды и позволить ему повернуть мягко на рокер ночь на RT.
- Для выполнения ДНК осадков, на следующий день передать содержимое трубки до 5 мкм фильтра труб. Спин при 600 х г на 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте трубки вращаться дольше, чем 10 с, как гель проходит через фильтр. - Добавьте 2 злигегликогена, 30 л из 3 М НаОАК, 2 Л из 0,1x гранулы краски и 975 л 100% этанола в элетированную ДНК. Спин при 17 000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
- Откажитесь от супернатанта и добавьте 75% этанола для мытья гранул. Спин при 17000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и инкубировать трубки при 37 градусах Цельсия, чтобы полностью испариться этанола.
- Отрежь гранулы с 12 мл 10 мм Tris-HCl рН 8,5.
- Выполните проверку качества библиотеки, разбавив очищенную кДНК в 10 разов (1:10) и используя 1 л разбавленной кДНК для работы на биоанализаторе.
- Убедитесь, что размер продукта кДНК соответствует диапазону небольшой РНК (136–160 bp) в электроферограмме. Рассчитайте общую молярность для каждого образца. Нормализовать каждый образец до 2 нМ с помощью Tris-HCl рН 8,5.
- Денатурации и последовательности очищенной кДНК.
- Объедините библиотеки, смешивая равные объемы каждого образца 2 нМ в одну трубку ПЦР мощностью 200 л. Добавьте 10 юл свежеприготовленных 0,2 N NaOH до 10 Зл объединенной библиотеки.
- Смешайте сразу вихрем, и спина на 280 х г в течение 1 мин. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Добавьте 10 юл 200 мм Tris-HCl pH 7 до 20 л денатурированной библиотеки. Смешайте путем вихря и спина на 280 х г в течение 1 мин.
- Добавьте в библиотеку 970 кЛ буфера гибридизации прехиллов и хорошо перемешайте путем вихря. Библиотека находится в концентрации 20 pM. Держите на льду, пока он, наконец, разбавленной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательное разбавление делается прямо перед запуском на секвенсоре. - Добавьте 117 л денатурированной библиотеки к 1183 л прехилизированного буфера гибридизации. Смешайте путем инвертирования трубки и пульс центрифуги. Окончательная концентрация библиотеки в настоящее время 1,8 pM.
- Добавьте 1,3 л PhiX в 1,3 мл конечной библиотеки. Чтобы инициировать запуск на секвенсоре, следуйте на экране шаги на программном интерфейсе, просмотрите параметры выполнения, в том числе тип чтения (одно прочитано), длина чтения (количество циклов для каждого чтения), идентификатор библиотеки и выберите Start.
5. Анализ данных
- В конце секвенсора получите полученные данные о секвенировании в виде быстрых файлов. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа полученных данных по секвенированию.
- Откройте приложение для быстрого набора инструментов и нажмите кнопку «Запуск».
- Выберите файлы из списка образцов программного обеспечения и выберите, где будут сохранены данные.
- Добавьте имя строки, которое применяется к каждой обрезанной последовательности. Держите строгость до 0,9. Ввейте последовательность адаптера для отделки как "TGGAATCtCTCGGGTGCCAAGG" с конца 3' каждого последовательного образца. Расширьте вкладку «Читаем фильтрация» и выберите минимальную длину чтения «5». Выберите поле Подтверждения и нажмите кнопку Продолжить, чтобы начать обрезку. Обрезанные файлы будут сохранены в папке проекта по окончании анализа.
- Откройте небольшое приложение RNA v.1.0 на программном обеспечении и нажмите кнопку запуска.
- Выберите проект, в котором файлы будут сохранены и отправлены после анализа.
- Выберите функцию Роман miRs и дифференциальные miRs в приложении. Сегрегировать группы как«Контроль»и«Тест»для дифференциального анализа и добавляйте обрезанные файлы для анализа в своих группах.
- Выберите кнопку «Запуск» для начала анализа. После анализа загрузите полученные файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Библиотека была подготовлена после изоляции РНК и была проведена проверка качества. Очистка геля для усиленной библиотеки кДНК, подготовленной из РНК, изолированной из микрорасчленированных тканей и ЭВ сыворотки, показана на рисунке 1 и рисунке 2. Размер продукта для адаптер-лигатных miRNAs соответствовал примерно 136-160 bp для каждого образца. Рисунок 1A-B отмечены, чтобы показать диапазон геля, который должен быть точно вырезан для небольшой подготовки библиотеки РНК. На рисунке 2A-B показаны гель электрофорез и электроферограммы для микрорасчлененных тканей и эвакуаций, полученных в сыворотке. Дополнительная диаграмма 1 показывает репрезентативный результат электрофорезной машины и метод расчета молярности.
Были выполнены шаги для получения метрик библиотеки до запуска секвенсора. На рисунке 3 показаны репрезентативные метрики из небольшого секвенирования РНК, демонстрирующие ожидаемую плотность кластера, балл кК, процент прохождения кластера и расчетные показатели урожайности и ошибок. Рисунок 3А и рисунок 3C показывают таблицы со всеми параметрами выполнения и график для оценки КК в течение различных циклов. Рисунок 3B, D являются графическими представлениями о частоте ошибок для выравнивания PhiX в течение различных циклов. Предоставленные данные взяты из программного обеспечения для анализа на месте.
Для анализа секвенированных образцов из микрорассеченной ткани и эвакуаторов, полученных из сыворотки, использовалось коммерчески доступное программное приложение(Таблица материалов). Секвенированные образцы были обрезаны от последовательностей адаптера с помощью инструментария FASTq с последующим анализом на"Малой РНК v.1.0"приложение. На рисунке 3 показаны полученные данные при анализе. Таблица 1 и таблица 2 показывают общее количество считываемых от микрорасчлененных тканей и сыворотки полученных EVs секвенирования перспективе. На рисунке 3А и рисунке 3В показано небольшое распределение длины РНК для двух источников выборки.
Рисунок 1: Подготовка библиотеки для секвенирования небольшой некодирующей РНК. Полякриламид кДНК гель для усиленных библиотек из (A) микрорасчлененных РНК ткани FFPE и (B) РНК из очищенных ЭВ, полученных сывороткой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Проверка качества для секвенирования небольшой некодирующей РНК. Представительное изображение для геля электрофорез и электроферограмма для очищенной библиотеки кДНК для(A) микрорасчлененных тканей FFPE и (B) сыворотки полученных ЭВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Выполнить метрики для небольшого запуска секвенирования РНК. Табулярное и графическое представление параметров выполнения % - 30 евро, плотность кластера, кластерный проходной фильтр, расчетная урожайность и оценка для секвенирования от(A)микрорасчлененных тканей FFPE и (C) eVs, полученных сывороткой. Графическое представление частоты ошибок для выравнивания PhiX в течение различных циклов для секвенирования от(B)микрорасчлененных тканей FFPE и (D) сыворотки полученных EVs. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение для частоты ошибок для каждого цикла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Ожидаемые результаты от небольшого некодирующего рнкового секвенирования. Малые длины чтения РНК для библиотеки от (A) Микрорасчлененные ткани FFPE и (B) сыворотки полученных EVs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Образец | Полное секвенирование |
| 1 | 92,68,658 |
| 2 | 70,00,551 |
| 3 | 1,56,41,204 |
| 4 | 1,50,46,681 |
| 5 | 1,42,82,756 |
| 6 | 1,27,38,970 |
| 7 | 1,57,21,318 |
| 8 | 88,51,578 |
| 9 | 1,32,16,879 |
| 10 | 1,14,66,162 |
| 11 | 1,91,14,932 |
Таблица 1: Общее секвенирование считывает для небольшого секвенирования РНК из микрорасчлененной ткани FFPE. Процент считываемых, соответствующих небольшим РНК для секвенированных образцов FFPE, которые были получены после анализа.
| Образец | Полное секвенирование |
| 1 | 2,30,88,960 |
| 2 | 1,77,69,806 |
| 3 | 90,37,884 |
| 4 | 87,26,243 |
| 5 | 73,23,571 |
| 6 | 2,89,37,388 |
| 7 | 76,52,149 |
| 8 | 1,30,07,122 |
| 9 | 54,34,386 |
| 10 | 93,05,941 |
| 11 | 94,53,760 |
| 12 | 82,79,773 |
Таблица 2: Общее секвенирование для небольшого секвенирования РНК из очищенных ЭВ сыворотки. Процент считываемых, соответствующих небольшим РНК для секвенированных образцов EV, полученных после анализа.
Дополнительная цифра 1: Проверка качества для секвенирования небольшой некодирующей РНК. Представитель результаты работы электрофорезной машины, показывающей общую моляритство указанного образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы описываем протокол для изоляции РНК от тканей FFPE и EVs, полученных из сыворотки, с использованием комплектов, которые были оптимизированы для повышения урожайности и качества изолированных РНК. Кроме того, очищенные РНК использовались для генерации библиотек кДНК для секвенирования мелкой РНК. Оба перечисленных шага имеют важное значение для определения качества и глубины последовательности считывания, которые являются конечным результатом запуска24. Поэтому оптимизация этих важнейших шагов имеет решающее значение для успешного секвенирования.
Важным шагом в изоляции РНК, полученной из FFPE, является переваривание протеиназой K, которое позволяет вывести из ткани перекрестный формалин. Этот шаг был оптимизирован путем инкубации образца при 55 градусах и 80 кв. м в течение примерно 16-18 мин каждый. Это привело к эффективному повышению качества изолированной РНК за счет увеличения соотношения 260/280. Секвенирование считывательных считываемых часто изменяется для запуска, который включает в себя несколько образцов. Таким образом, контроль количества РНК-входов в начале подготовки библиотеки позволяет обеспечить единообразие библиотеки. Использование нормализованной РНК помогает выравниванию последовательности работать равномерно по различным образцам. Наиболее важным шагом в подготовке библиотеки является очищение усиленного адаптера ligated cDNA. Очень важно тщательно вырезать гели выше маркера 140 bp, потому что небольшое отклонение в сторону нижней части маркера приводит к загрязнению адаптера димеров. Наконец, нормализация библиотеки кДНК является наиболее важным шагом протокола секвенирования и должна быть сделана точно на основе рассчитанной нормальности от электрофорасиса машины.
В случае загрязнения адаптера димер, можно перезапустить очищенную библиотеку на геле TBE и переочищать нужный продукт. Однако, выход библиотеки кДНК в такой экстракции значительно снизилась, что может повлиять на длину чтения из образца. Для оценки концентрации очищенной библиотеки кДНК можно разбавить образцы перед запуском на электрофоресе, основываясь на интенсивности продукта в гелях TBE, и подготовить различные разбавления (т.е. 5x, 10x или 25x). Для дальнейшего улучшения оценки очищенных библиотек кДН, запуск qPCR в дополнение к электрофоразису помогает оценить уровни шаблонов и позволяет более точной нормализации.
Хотя ультрацентррифегация является золотым стандартом для изоляции ЭВ из различных источников, более низкая урожайность частиц от такой добычи часто ограничивает использование этого метода в очистке ЭВ, где исходный материал ограничен и значительное количество входиной РНК необходим для приложений ниже по течению. Таким образом, использование общего экзосомного изолаторного реагента обеспечивает гораздо более быстрый и более высокий метод выхода для изоляции EV из ограниченных источников, таких как сыворотка и плазма из клинических образцов.
В целом, этот протокол детализирует методы генерации библиотек кДНК в более эффективной форме, принимая во внимание урожайность и качество библиотек кДНК, чтобы получить точное и всеобъемлющее секвенирование считывания. Учитывая потенциал экзосомы в качестве источника биомаркеров рака, этот метод для последовательности следующего поколения (NGS) анализ ы экзосомального содержания miRNA будет полезен для исследований в этой области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы объявить.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается армии США медицинских исследований Приобретение деятельности (USAMRAA) через Idea Development Award underAward No. W81XWH-18-1-303 и W81XWH-18-2-0013 и дополнительно Премии Нет. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, и W81XWH-18-2-0019 Рак предстательной железы Биопозиторий сети (PCBN). Подтверждена также поддержка авторской лаборатории Национальным институтом рака при Национальных институтах здравоохранения (Grant Number RO1CA177984). Раджвир Дахия (Rajvir Dahiya) является старшим научным сотрудником Департамента по делам ветеранов, BX004473 и финансируется NIH-UO1CA199694 (RD). Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации являются мнениями автора и не обязательно одобрены Министерством обороны или армией США. Мы благодарны Джуди Шигенага, директору основного объекта в Сан-Франциско VAMC, за ее помощь с nextSeq 500 секвенсор.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C.
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M.
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D.
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
