Summary
这里演示的是一种高效且经济高效的方法，用于从产后小鼠小脑中纯化、培养和分化白质干细胞。
Abstract
大多数小脑神经元产生于两个胚胎干细胞利基：一个红唇壁，它产生所有的小脑外皮谷类神经元，和一个心室区利基，它产生抑制性GABAergic Purkinje细胞，这是构成深小脑核和伯格曼胶质的神经元。最近，第三个干细胞利基被描述为从心室区利基的继发生殖区。这种利基的细胞由细胞表面标记素-1定义，并定位为产后小脑的白质。这个利基占晚期出生的分子层GABAergic间神经元以及产后生成的小脑星细胞。除了他们的发育作用，这个利基正在获得翻译的重要性，其参与神经退化和肿瘤发生。由于缺乏有效的纯化技术，这些细胞的生物学一直难以破译。这里演示的是净化、培养和分化这些产后小脑干细胞的有效方法。
Introduction
小脑长期以来一直被认为是协调自愿运动的主要神经元回路1。它接收来自神经轴的宽条输入，包括来自外围的感知信息，从而微调电机输出和协调运动。最近，它还被牵连到通过可能使用类似的信息处理网络22，3，43,4来调节认知和情感。
成人小脑由外小脑皮层和内白质组成。在这些结构内穿插的是深内回核。与神经系统的其他部分类似，小脑的发展是由多能祖细胞（干细胞）的增殖推动的，这些细胞迁移并分化以产生这种组织良好的结构。在早期发育（E10.5_E13.5）中，围绕发育的第四个心室的心室干细胞利基产生GABAergic神经元（即珀金耶细胞、卢加罗细胞、高尔基细胞）以及伯格曼利亚55、6、7、8。6,7,8
在发育后期（产后第一周），红唇中的第二个干细胞利基产生MATH1和内丁表达的祖体，产生兴奋颗粒神经元9,109，10，11，12。,11,12最近，第三个干细胞利基被描述13。这些细胞表达prominin-1（也称为CD133），一种膜覆盖的糖蛋白，定义肠道和造血系统14、15、16的干细胞子集。14,15,16体内命运图显示，这些干细胞在前三个产后周内产生关键的分子层间神经元（即篮子细胞和斯特拉特细胞）以及星细胞。过去，在体外研究这些细胞是很困难的，因为先前的方法需要昂贵且耗时的技术（即荧光激活细胞分拣[FACS]），这些技术依赖于promin-1染色12、13、17。12,13,17该协议描述了一种基于免疫磁性的方法，用于分离这些干细胞，然后可以很容易地培养和分化。
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Protocol
所有动物实验都符合NIH的《实验室动物护理和使用指南》（2011年），并经西北大学IACUC（IS00011368议定书）批准。
1. 准备解决方案
- 制备由无菌酚类红含量Dulbecco的磷缓冲盐水（DPBS）制成的组织分离溶液，包括木瓜素（100 U/ml）、半胱氨酸（0.2毫克/毫升）和DNase（250 U/ml）。
- 制备DNase溶液稀释100毫克的DNase I（一瓶）的嗜血粉在50 mL的H2O.混合良好，并过滤库存溶液。准备 10 mL 股票等号。将一个库存管划分为 0.5 mL 单次使用等号。将这些单次使用等号储存在-80°C。
- 制备磁柱缓冲液X：0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA溶液，制备磁分离试剂。
- 要制备神经球体介质，请使用含有青霉素/链霉素的神经底质与L-谷氨酰胺，并补充2%B27，20 ng/mL人类重组表皮生长因子（EGF），和20 ng/mL人类重组基本纤维细胞生长因子（bFGF）。
- 要制备分化介质，请使用神经基础介质，并补充10纳克/mL分化因子血小板衍生生长因子（PDGF-AA）或10纳克/mL白血病抑制因子（LIF）和2%B27。
- 使用超低附件 12 孔 （3.5 厘米2） 和 6 孔 （9.6 厘米2） 培养板。
2. 小脑剖面
- 用同一个麻醉小鼠小狗（ P3 - P7 ），并用手术剪刀斩首。
- 用70%乙醇喷洒分离的小狗头部。
- 将每头转移到一个空无菌的10厘米培养皿中。使用微切切剪刀分离皮肤，然后沿着中线运行剪刀下垂来去除头骨。
- 使用#7钳子，从脑干中开始剥下头骨。使用铲子小心地抬起大脑，保持小脑完好无损，并将大脑转移到一个新鲜的无菌10.0厘米的盘子中，含有15 mL的冰冷汉克斯平衡盐溶液（HBSS）溶液。
- 将包含大脑的盘子放在解剖显微镜下。使用精细的#5钳，从小脑中取出脑和大型血管，并使用铲子将小脑从脑干中分离出来。
- 将小脑转移到含有5.0 mL冰冷HBSS溶液的15 mL离心管中。用 5.0 mL 的 HBSS 冲洗和除掉 3x 来清洗小脑。
注：每个小脑应放置在自己的管进一步处理。
3. 细胞悬浮制剂
- 最后冲洗后，加入5 mL的木瓜素组织分离溶液（基于以前的工作13，18），已预热至37°C。13,在水浴中，在37°C下孵育组织15分钟。使用螺母混合器或手动将管上下反转 3x-5x，缓慢混合内容。
- 准备一个宽直径（普通玻璃移液器）和窄直径巴斯德移液器（通过加热在Bunsen燃烧器上加热进行抛光），如前所述的19。
- 用 5 mL 的 HBSS 溶液清洗组织 3x，避免在用手破坏时失去组织。
- 取出最后一次 HBSS 洗涤，并在组织中加入 5 mL DPBS 溶液，其中含有 250 μL 的 DNase 溶液。使用宽直径巴斯德移液器三分10倍至15倍，分离组织。轻轻地执行此步骤，以避免气泡的形成。
- 然后在水浴中以37°C孵育泥浆10分钟，通过倒置和拉直管混合。
- 使用直径缩小的巴斯德移液器进一步三分组织浆料 10 倍。如果仍有大块组织，用移液器尖端轻轻按压管底部的纸巾，然后继续移液，直到细胞达到细悬浮液。
- 在37°C下孵育组织10分钟，重复以前的混合步骤。
4. 干细胞免疫标签
- 将离心机管放在冰上，并在接下来的步骤中使用冰冷溶液。通过40μm细胞滤网将分离的细胞应变到50mL离心管中。使用 10.0 mL 的 HBSS 解决方案在过滤器顶部，以确保细胞通过此附加解决方案中的网格。
- 将过滤的电池转移到新鲜的15 mL离心管中，在4°C下以300 x g将电池悬浮液离心10分钟。小心使用真空吸气器吸气并完全丢弃上清剂。
- 在160μL的磁柱缓冲液中重新悬浮颗粒。要在磁标前获得单细胞悬浮液，通过 30 μm 尼龙网通过细胞来去除细胞团块，否则会堵塞柱子。
- 在每个15 mL管中加入40μL的抗promin-1微珠，在冰箱中混合和孵育15分钟，以便抗体与promin-1表达细胞结合。
- 通过加入1.0~2.0 mL的柱缓冲器X和300 x g的离心机清洗细胞10分钟。
- 在柱形缓冲器 X 的 1.0 mL 中重新悬浮颗粒。
注：如果在用1.0 mL柱缓冲器X重新悬浮颗粒后看到小团块，则应使用巴斯德移液器的尖端小心去除它们，否则这些团块可以在细胞分拣过程中阻塞磁柱。
5. 磁柱制备、细胞分拣和电镀
注：必须同时执行不同基因型条件（疾病与控制）的磁分离，因为任何延迟都可能影响神经球形态。
- 通过将磁柱放置在暴露于磁场的磁支架上，准备磁柱。使用 500 μL 缓冲液 X 冲洗一次，将滴入离心机管中的缓冲液进行丢弃。
注：为每个实验准备新鲜的磁柱缓冲器X;如果不是，那么干细胞产量将很低。 - 将标记的细胞悬架应用于列。收集包含未标记的细胞的流道，这些细胞主要由小脑神经元/胶质混合细胞组成新鲜的15 mL管（图1A）。
- 用 500 μL 的缓冲器 X 清洗柱 3x（每次洗涤大约需要 2⁄4 分钟）。
注：富含小脑颗粒神经元的小脑神经元/胶质混合培养物可以作为这种纯化步骤的有用副产品。 - 从磁场中取出柱，放入 1.5 mL 管中。将1.0 mL培养介质（神经球介质）添加到柱中，并将柱塞推入柱中，将标有promin-1珠子的细胞冲出一个新的1.5 mL猎鹰管中。
- 为了提高prominin-1标记细胞的纯度，按照步骤5.1_5.4将洗脱的细胞传递给第二列。
- 用血细胞计对细胞进行计数。典型的产量是每小脑107个细胞。根据下游实验所需的密度，将细胞板板板板板（6 或 12 孔）板。
6. 神经球和分化的传递
- 在神经球介质（5，000个细胞/井）的超低附着12孔板上对promin-1标记的干细胞进行板子。
- 7-10天后，细胞分裂以产生球形浮动神经球（原发神经球）。
注：在这个实验中，在数量上扩大的次神经球被生成供进一步使用。初级神经球群不用于这些实验，因为它们可能包含污染细胞，这些细胞没有干细胞特性，并且可以与神经球团合在一起。 - 对于传路，使用1.0 mL移液器尖端将主神经球与培养介质一起转移到15 mL无菌离心管。在300 x g的离心下将神经球圈中丸5分钟，并丢弃上清液。
- 在含有帕辛或0.05%胰蛋白溶液的组织分离介质中重新悬浮颗粒。在37°C孵育10分钟。
- 将细胞悬浮液在300 x g下离心5分钟。将细胞悬浮在神经球介质5mL中，并用塑料巴斯德移液器机械分离细胞，缓慢上下移液10倍。
- 如前面所述，在神经球介质中对细胞（再次）进行板盘。在培养7~10天后，该板应富含继发性神经球。
注：这些培养物可以通过高达8倍具有良好的效率，之后神经球的大小往往较小，暗示增殖减少。 - 在血细胞计上计数细胞，并针对未来在多D-Lyine涂层板（6 或12孔）上进行实验，将细胞作为最佳数量。
- 要分化干细胞，除向颗粒添加分化介质外，通过离心收集神经球从第二通道到第八通道。
注：经过7天的体外，干细胞分化成神经元、星细胞和寡核细胞，通过用神经元标记β-III图布林、星形标记GFAP和寡核糖体制造者O4染色来证明。
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Representative Results
Prominin-1阳性产后小脑干细胞在神经球介质中形成神经球，富含生长因子（EGF和bFGF）。这些神经球对promin-1染色呈阳性，这是用于分离的标记，也是其他干细胞标记物（如内丁和GFAP13）的污渍（图1）。干细胞标记表达在整个培养过程中保持，最多8个通道20。当退出生长因子时，在LIF和PDGF-AA（支持神经元和胶质分化21，22,22的因素）的存在下，神经球分化成神经元和胶质谱系（图2）。
图1：产后小脑中分离的promin-1干细胞。（A） 小脑干细胞使用免疫磁海脑-1珠分离。顶部面板：纯化干细胞（柱系）形成具有广泛增殖和自我更新特性的神经球。未绑定到柱的细胞（流过）无法形成神经球;相反，它们成为小脑神经元/胶质混合细胞（β-III图布林/GFAP）。底部面板：由promin-1形成的神经球和表达干细胞特异性标记的细胞：内丁、海平-1和GFAP。（B） 细胞在流过染色阴性干细胞标记素-1和内阴和正神经元标记β-III图布林。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：正神经球的分化。在存在分化因子（PDGF-AA或LIF）的情况下，prominin-1阳性神经球分化成神经元（β-III图布林）、星形细胞（GFAP）和寡核糖（O4）。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
在产后生命的前3周，Prominin-1表达的小脑干细胞存在于潜在的白质中。它们的增殖受到由Purkinje细胞17支持的声波刺猪通路的严格控制。这些干细胞/祖细胞有助于后来出生的GABAergic间神经元，称为篮子细胞和斯特拉特细胞。这些间神经元存在于分子层中，它们突触到Purkinje细胞上，并通过GABAergic抑制13、17、2317,雕刻PC地形13和功能。23除了形成内神经元外，这种干细胞群还产生所有产后衍生的小脑星细胞17、24。17,
该协议描述了一种简单且经济高效的方法，用于从产后小鼠小脑中纯化promin-1/CD133干细胞。干细胞必须在超低的附着板中培养。在正常板块中培养这些干细胞可能导致神经球附着在表面，导致干细胞增殖和分化率低。在这里，每5，000个细胞200-300个神经球的产生对应于单个小脑的大约1 x 107个细胞的干细胞产量。这与基于 FACS 的战略的描述相当，这种策略的成本要高 10 倍。此外，FACS设备需要昂贵的设置和训练有素的人员，而且不容易获得。
这些干细胞在癌症以及神经发育和神经退行性疾病的研究中也越来越具有转化意义25、26、27。26,2725这些干细胞在早期生命中不受控制的增殖导致髓细胞瘤28，而来自我们实验室的研究表明，它们的异常增殖和分化可导致遗传性疾病脊柱小脑aaaaasa120型的后期小脑退化。这些新协议对于研究这些细胞并提供新的见解，了解它们在健康和疾病中的作用将很有价值。这些方法还可能导致中风或创伤后再生疗法的进步，以及对大脑的其他侮辱，这些侮辱需要神经再生。可以想象，这些技术可以推广，以提取promin-1表达干细胞从其他组织，如肠道和骨髓，其中也表达15，29。15,
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Disclosures
不声明任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢蛋白石实验室成员的建议。这项工作得到了NIH授予1RO1 NS062051和1RO1NS08251（Opal P）的支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
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