Une méthode révisée pour induire le lymphœdème secondaire dans le Hindlimb des souris

Summary

Ce modèle animal permet aux chercheurs d’induire un lymphœdème secondaire statistiquement significatif dans le membre postérieur des souris, d’une durée d’au moins 8 semaines. Le modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie du lymphœdème et pour étudier de nouvelles options de traitement.

Abstract

Les modèles animaux sont d’une importance primordiale dans la recherche sur le lymphœdème afin de comprendre la physiopathologie de la maladie, mais aussi d’explorer les options de traitement potentielles. Ce modèle de souris permet aux chercheurs d’induire un lymphœdème significatif d’une durée d’au moins 8 semaines. Le lymphœdème est induit à l’aide d’une combinaison de radiothérapie fractionnée et d’ablation chirurgicale des lymphatiques. Ce modèle exige que les souris reçoivent une dose de 10 rayonnements gris (Gy) avant et après la chirurgie. La partie chirurgicale du modèle implique la ligature de trois vaisseaux lymphatiques et l’extraction de deux ganglions lymphatiques de l’arrière-pays de la souris. Avoir accès à des outils microchirurgicaux et un microscope est essentiel, en raison des petites structures anatomiques des souris. L’avantage de ce modèle est qu’il se traduit par un lymphœdème statistiquement significatif, qui fournit une bonne base pour évaluer différentes options de traitement. C’est également une option grande et facilement disponible pour la formation microchirurgicale. La limitation de ce modèle est que la procédure peut prendre du temps, surtout si elle n’est pas pratiquée à l’avance. Le modèle donne lieu à un lymphœdème quantifiable objectif chez la souris, sans causer de morbidité sévère et a été testé dans trois projets distincts.

Introduction

Le lymphœdème est caractérisé par une accumulation de liquide lymphatique qui conduit à un gonflement des tissus localisés, qui se produit principalement en raison d’une altération ou perturbé le flux lymphatique dans les vaisseaux lymphatiques¹. Le flux lymphatique peut être altéré ou perturbé par une infection, une obstruction, une blessure ou des malformations congénitales dans le système lymphatique². Ces étiologies ont comme conséquence l’accumulation du fluide lymphatique, qui mène à un état chronique d’inflammation, ayant pour résultat la fibrose suivante, aussi bien que le dépôt du tissu adipeux^3. Le lymphœdème peut être classé comme lymphoedème primaire ou secondaire. Le lymphœdème primaire est causé par des anomalies du développement ou une mutation génétique^2,4. Le lymphœdème secondaire se produit en raison d’une maladie systémique sous-jacente, d’une chirurgie ou^d’untraumatisme²,⁴. Le lymphœdème secondaire est la forme la plus commune de lymphœdème dans le monde². Dans les pays développés, la cause la plus fréquente de lymphœdème secondaire est la thérapie oncologique comme la radiothérapie adjuvante et la dissection des ganglions lymphatiques⁵. Le lymphœdème est plus fréquent chez les patientes atteintes d’un cancer du sein, mais peut également se développer chez les patients atteints de cancer gynécologique, mélanome, génito-urinaire ou cervical⁶. Il a été suggéré que de toutes les femmes diagnostiquées avec le cancer du sein, 21% développeront le lymphœdème^7.

Le lymphœdème peut être stressant pour le patient à la fois physiquement et psychologiquement. Les patients atteints de lymphœdème ont un risque accru d’infection^5,8,9, mauvaise qualité de vie et peut développer une anxiété sociale et des symptômes de dépression¹⁰. Les complications du lymphœdème chronique conduisent au coût élevé des soins et à une charge accrue de la maladie^9,11. Les résultats ont également suggéré que le lymphœdème pourrait être associé à un risque accru de décès après le traitement du cancer du sein¹². La gestion conservatrice telle que la compression de la zone affectée, le drainage lymphatique manuel et les soins de la peau généraux demeurent l’approche de première ligne. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif⁶. Bien que des progrès aient été réalisés dans le domaine de la thérapie chirurgicale et médicale, il y a encore place à l’amélioration. Plus de recherche, fournissant la perspicacité dans la pathophysiologie et la progression de la maladie, est nécessaire pour permettre aux cliniciens de fournir de meilleures options de traitement pour les patients^5.

Des modèles animaux sont utilisés dans la recherche préclinique pour comprendre la physiopathologie des maladies et développer des options de traitement potentielles. Plusieurs modèles animaux de lymphœdème différents ont été établis chez les canines^13,14, lapins¹⁵, moutons¹⁶, porcs^17,18 et les rongeurs^{19,20, 21,22,23,24}. Le modèle de rongeur semble être le modèle le plus rentable, lors de l’étude de la reconstruction de la fonction lymphatique, en raison des rongeurs étant facilement accessibles et relativement peu coûteux²⁵. La majorité des modèles de souris se sont concentrés sur induire le lymphœdème dans la queue des souris^21,22,23. Le modèle de queue est très fiable mais la technique chirurgicale exacte pour induire le lymphœdème varie considérablement dans le matériel publié précédemment. Ceci a comme conséquence des fluctuations dans la durée et la robustesse du lymphœdème développé présenté dans la litière connue^25. Différentes techniques sont également utilisées pour induire le lymphœdème dans le modèle de l’arrière-pays et elles donnent également des résultats variables, mais le modèle de membre postérieur pourrait être plus facile à comprendre d’un point de vue translationnel. Les modèles précédents de lymphœdème ont été entravés par la résolution spontanée de lymphœdème et donc un modèle reproductible et permanent de lymphœdème est nécessaire^25. Les chercheurs ont déjà essayé d’augmenter la dose de rayonnement, pour empêcher la résolution spontanée de lymphœdème, mais ceci a souvent mené à la morbidité grave suivante^25.

Ce modèle a comme conséquence le lymphœdème statistiquement significatif, sans causer la morbidité grave, en combinant la microchirurgie avec la radiothérapie. Le modèle a été révisé à partir d’un modèle chirurgical précédent en ajoutant une dose d’irradiation qui induit le lymphœdème, sans causer de morbidité sévère²⁶. Il offre également une excellente occasion pour la formation en microchirurgie. L’accès à l’équipement microchirurgical et au microscope est nécessaire, en raison des petites structures anatomiques des souris. L’intervention chirurgicale peut être effectuée lorsque l’utilisateur a appris des techniques microchirurgicales de base, telles que la suture avec des instruments microchirurgicaux. Les opérateurs qui ont effectué cette procédure ont tous regardé des vidéos didacticiels d’Acland sur les conditions préalables des compétences microchirurgicales (1981) et de la technique de base de la microsuture (1985). Nous recommandons de pratiquer l’intervention chirurgicale 8 à 10 fois avant de l’utiliser dans la recherche. La pratique de la procédure garantit que moins d’erreurs sont commises et que la procédure peut être effectuée plus efficacement. Une fois maîtrisée, l’intervention chirurgicale peut être effectuée en 45 minutes.

Protocol

Les animaux étaient hébergés dans l’établissement de soins aux animaux de l’Université du Danemark méridional, conformément aux lignes directrices de l’établissement. Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Inspection des expériences animales, ministère de l’Environnement et de l’Alimentation du Danemark. 1. Irradiation pré-chirurgicale REMARQUE : L’irradiation préchirurgicale a lieu 7 jours avant la chirurgie. …

Representative Results

Cette procédure a déjà été utilisée dans trois expériences distinctes. Toutes les expériences ont été faites par différents chercheurs principaux qui sont tous co-auteurs de cet article. Dans les trois expériences, un grand soin a été pris pour adhérer à la même procédure que décrite dans ce protocole. Dans chacun des trois expériences, le lymphœdème secondaire a été induit dans un membre postérieur tandis que l’autre membre postérieur a servi de contrôle. Les v…

Discussion

Il y a quelques étapes critiques dans ce protocole. Tout d’abord, il est important que les chercheurs prennent des précautions de sécurité lorsqu’ils travaillent avec la radioactivité. Deuxièmement, pendant la partie chirurgicale de ce protocole, il est important de commencer la procédure une fois que la souris a été anesthésié et le terminer sans pauses inutiles. Ceci est important pour éviter une période chirurgicale excessivement longue pour l’animal et pour éviter que l’anesthésie perde l’effet pendant…

Materials

10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture – Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator – ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad – PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer – PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder – Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V – 25 mg/ml	Guerbet
Scissors – Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation – D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic – 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment – viscotears	Bausch & Lomb